Produksi Enzym α-Amilase dari Bacillus Amyloliquefaciens Ardita Rizky (1306402293) Fakhri Rafiki (1306447751) Giovanni Anggasta P. (1306412155) Julia Nofadini (1306370972) Terry M. Octaryno (1306370770) Vina Damayanti (1306370865) Kelompok 2

Jenis Enzim Amilase Alfa Amilase Beta Amilase Glukoamilase Menghasilkan maltotriose dan maltosa Glukoamilase menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta menghasilkan hidrolisis oleh enzim a-amilase

Struktur molekular: 1,4-α-glukan-glukanohidrolase Enzim α-Amilase Struktur molekular: 1,4-α-glukan-glukanohidrolase Amilase merupakan enzim yang menghidrolisa molekul pati untuk menghasilkan produk bervariasi, salah satunya yaitu dekstrin (Chung, et al., 197; Windish dan Mhatre, 1965).

Karakteristik Enzim Amilase Karakteristik alpha-amylase, 1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase, pancreatic alpha-amylase, α-amilase, PA Alpha-amilase pada umumnya aktif bekerja pada kisaran suhu 25 0C hingga 95 0C. Penambahan ion kalsium dan klorida dapat meningkatkan aktivitas kerja dan menjaga kestabilan enzim ini. Alfa-amilase akan memotong ikatan glikosidik α-1,4 pada molekul pati (karbohidrat) sehingga terbentuk molekul-molekul karbohidrat yang lebih pendek.Hasil dari pemotongan enzim ini antara lain maltosa, maltotriosa, dan glukosa.

Karakteristik Enzim Amilase Karakteristik alpha-amylase, 1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase, pancreatic alpha-amylase, α-amilase, PA Gambar ikatan α1,4 glikosida yang diputus oleh Enzim alfa amilase

SUMBER MIKROBA

Sumber Enzim yang telah digunakan untuk menghasilkan alpha amilase: Tumbuhan Hewan Mikroorganisme Untuk produksi industrial, biasanya invertase berasal dari yeast atau bakteri tertentu yang diisolasi yang telah digunakan untuk menghasilkan alpha amilase: Bacillus coagulans Bacillus Amyloliquefaciens B. stearothermophilus B. Licheniformis.

Sumber Enzim Amilase Bacterial α-Amilase Di masa lalu, telah ada penelitian yang luas mengenai produksi α-amilase dari mikroba. Ada 2 alasan utama menggunakan sumber mikroba: Pertumbuhan mikroorganisme yang cepat dapat mempercepat produksi enzim. Mikroorganisme lebih mudah ditangani dibandingkan dengan hewan dan tumbuhan. Mereka membutuhkan ruang yang lebih kecil dan berfungsi sebagai sumber biaya yang lebih efektif. Mikroorganisme dapat dengan mudah dimanipulasi menggunakan rekayasa genetika atau cara lain. Mikroorganisme juga dapat diberi perlakuan dengan memperbaiki untai DNA, mutasi dan perubahan lainnya yang dapat mengoptimalkan produksi α-amilase. Mikroorganisme juga dapat dimodifikasi untuk memenuhi kebutuhan industri dan untuk mendapatkan karakteristik enzim yang diinginkan seperti thermostability . Termostabil α-Amilase dapat meminimalkan risiko kontaminasi dan mengurangi waktu reaksi, sehingga menghemat cukup banyak energi. Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, dan Bacillus amyloliquefaciens diketahui sebagai penghasil α-amilase termostabil yang baik, dan ini telah banyak digunakan untuk produksi komersial dari enzim untuk berbagai aplikasi Amilase halofilik telah dikarakterisasi dari bakteri halofilik seperti Chromohalobacter sp., Halobacillus sp., Haloarcula hispanica, Halomonas meridiana, dan Bacillus dipsosauri.

SUMBER ENZIM Kondisi Optimum Produksi α-Amilase dari Bacillus Amyloliquefaciens Pencapaian Produksi Enzim Maksimum Substrat Gandum Durasi Jam ke – 24 (1,4986U/ml) Initial pH = 6 Suhu 30 – 60 °C Kelembaban 55 – 90%

Kondisi Optimum Enzim Amilase Suhu pH Suhu yang perlu berada di kisaran optimum : suhu untuk pertumbuhan sumber mikroba dan suhu dimana produksi maksimum enzim berlangsung. Suhu optimum untuk pertumbuhan dan produksi α-amilase yang ditemukan dalam strain B. licheniformis dan B. subtilis masing-masing 45°C sampai 46°C dan 50 ° C. Studi yang dilakukan oleh B. Jensen, et al. (1992) dan L. Buni, dkk. (1989) mengungkapkan bahwa produksi optimal amilase adalah antara 50-55 ° C untuk kultur jamur termofilik seperti Talaromyces emersonii, Thermomonospora fusca dan Thermomyceslanuginosus. Produksi enzim meningkat dengan peningkatan suhu sampai mencapai optimal Dengan peningkatan suhu lebih lanjut produksi enzim menurun. Hal ini mungkin disebabkan oleh hilangnya kelembaban di substrat yang mempengaruhi aktivitas metabolisme mikroba yang menyebabkan berkurangnya pertumbuhan dan penurunan produksi enzim. Enzim sensitif terhadap pH sehingga harus diperhatikan untuk mengontrol pH dari proses produksi. Pyrococcus furiosus menghasilkan α-amilase yang menunjukkan aktivitas pada pH optimum 6,5-7,5. Bacillus amyloliquefaciens menghasilkan enzim dengan pH optimum 7,0 . Halomonas meridiana dipelajari untuk optimasi produksi α-amilase. Studi ini mengungkapkan bahwa amilase yang menunjukkan aktivitas maksimal pada pH 7,0, yang relatif stabil dalam kondisi basa. PH optimum 9,0 diamati untuk menghasilkan enzim dengan aktivitas spesifik 138 U / mg dalam jamur Preussia minima.

Kondisi Optimum Enzim Amilase Durasi Fermentasi Substrat Jika proses ini dilakukan untuk jangka waktu yang lebih pendek dari durasi yang optimal hasil maksimum tidak dapat diperoleh. Aktivitas enzim meningkat dengan peningkatan waktu inkubasi sampai mencapai durasi optimal. Dalam kebanyakan kasus, produksi enzim mulai menurun jika waktu inkubasi meningkat lebih lanjut. Hal ini bisa disebabkan menipisnya nutrisi dalam medium atau pelepasan zat-zat beracun. Bacillus subtilis, produsen terkenal dari alpha amylase dipelajari dan penelitian menunjukkan hasil yang tinggi dari alpha amilase setelah 48 jam fermentasi. Sebuah aktivitas α-amilase optimum dari 62,470 U / g ditemukan setelah fermentasi selama 72 jam ketika diproduksi oleh Bacillus amyloliquefaciens. Sumber karbon yang umum digunakan sebagai substrat termasuk maltosa, sukrosa dan glukosa. A. tamarii aktif mensintesis α-amilase pada medium maltosa, pati dan glikogen dalam kondisi statis. Bacillus subtilis dipelajari untuk produksi α-amilase menggunakan fermentasi solid state selama 48 jam pada suhu 37 ° C dengan dedak gandum sebagai substrat. Sumber nitrogen yang digunakan untuk produksi α-amilase mungkin organik atau anorganik. Beberapa sumber nitrogen anorganik meliputi amonium sulfat, amonium klorida dan amonium hidrogen fosfat. Sumber nitrogen yang paling umum digunakan adalah pepton, ekstrak ragi dan kacang kedelai. Sumber anorganik seperti amonium klorida, amonium fosfat, dan amonium sulfat menghasilkan hasil enzim yang rendah.

Kondisi Optimum Enzim Amilase Kelembaban Tingkat optimal dari kelembaban dapat bervariasi, tergantung pada sumber mikroba yang digunakan. Untuk sumber jamur kadar air yang dibutuhkan kurang sedangkan sumber bakteri membutuhkan kadar air lebih untuk hasil yang tinggi dari enzim. Dalam sebuah studi dari produksi α-Amilase oleh Penicillium janthinellum kadar air bervariasi dalam kisaran 20- 80% dengan memvariasikan jumlah larutan garam yang digunakan dalam melembabkan partikel substrat. Untuk Aspergillus oryzae hasil maksimum ditemukan 9000 U / GDS pada kadar air awal 60% yang menurun drastis ketika kadar air meningkat menjadi 70%. Untuk B. amyloliquefaciens, studi yang dilakukan menunjukkan kadar air awal bervariasi dari 55- 90% untuk produksi enzim yang optimal. Pada kadar air rendah ada ketegangan air yang tinggi dan kelarutan rendah pada nutrisi menyebabkan yield enzim rendah. Dengan peningkatan kadar air pembengkakan substrat berlangsung dan menjamin penyerapan nutrisi yang lebih baik oleh mikroba. Tetapi dengan meningkatnya kadar air lebih jauh lagi menyebabkan yield enzim menurun karena jarak antar partikel berkurang dan dapat mengakibatkan aglomerasi partikel substrat. Selain itu pengurangan volume gas dan difusi gas mengakibatkan gangguan dalam transfer oksigen.

Kemasan Enzim Alpha Amilase di Pasaran BENTUK & KEMASAN PRODUK Kemasan Enzim Alpha Amilase di Pasaran

PROSES PRODUKSI

Neraca Massa Fermentor Mixer Centrifuge Separator 1 mL inoculum (1.5–2 × 108 cfu/mL) dari hasil kultur bakteri Supernatan (ekstrak kasar enzim) Fermented media + bakteri Suspensi bakteri dan enzim Centrifuge Separator Fermentor Mixer Pelet 2 g/L dedak gandum kering 25 mL 20 mM phosphate buffer

Tahapan Produksi Enzim Isolasi enzim dari Bacillus Amyloliquefaciens Peremajaan Isolat Produksi Amilase Isolasi Purifikasi

Isolasi Enzim dari Bacillus Amyloliquefaciens Produksi Enzim Isolasi Enzim dari Bacillus Amyloliquefaciens Preparasi Enzim Strain B. amyloliquefaciens ditumbuhkan dalam 100 mL Marine Broth (MB: 0,25% b/v pepton, dan 0,15% b/v ekstrak ragi dalam 50% v/v air laut) yang mengandung 0,005% b/v pati beras pada 300C dengan rotary shaker (150 rpm) selama 24 jam. Kerapatan sel ditentukan dengan mengukur OD pada 600 nm. Sel dikeluarkan dengan sentrifugasi (6000 x g, 20 min) dan supernatan kultur diendapkan dengan 0-70% amonium sulfat jenuh. Endapan didialisis terhadap 20 mM buffer Tris-HCl (pH 7,0). Fraksi amonium sulfat ini digunakan untuk studi lebih lanjut. 1

Pengujian Enzim Aktivitas α-amilolitik ditentukan dengan mengukur jumlah gula tereduksi yang dibentuk dengan menggunakan modifikasi metode dinitrosalicylic acid (DNS) dengan glukosa sebagai standar kalibrasi. Pengujian amilase dilakukan selama 10 menit dalam 50 mL campuran reaksi yang terdiri dari 25 mL 1% soluble pati dan 25 µL enzim encer yang sesuai dalam 50 mM penyangga universal (asam suksinat/NaH2PO4/glisin) pH 6,5 pada 500C. Aktivitas ini dihentikan dengan penambahan 50 µL larutan DNS (1% b/v DNS, 0,4 M NaOH, dan 30% b/v K-Na-tartrat). Campuran reaksi kemudian diinkubasi dalam bak air mendidih selama 10 menit. Selanjutnya, campuran reaksi didinginkan kembali sampai mencapai suhu kamar dan diukur absorbansi pada 500 nm. Semua tes dilakukan rangkap tiga. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan BSA sebagai standar (BioRad protein assay). 2

Metode Fermentasi α-Amilase SSF (Solid-state fermentation) fermentasi yang substratnya tidak larut dan tidak mengandung air bebas tetapi cukup mengandung air untuk keperluan mikroba. Media berfungsi sebagai sumber karbon, nitrogen maupun sumber energi (Taufik, 192).

TAHAPAN SSF substrat kering ↓ labu erlenmeyer autoklaf (121 °C selama 20 min) inakulasi (1 mL hasil kaldu kultur) inkubasi (37 °C selama 24 jam) Labu

Flow Diagram Produksi α-Amilase dari Bacillus Amyloliquefaciens Mempersiapkan Alat dan Bahan Menyiapkan nutrient agar sebagai media kultur bakteri Bacillus amyloliquefaciens Pengkulturan bakteri Bacillus amyloliquefaciens dengan menginkubasinya pada suhu 37°C selama 24 jam di dalam shaker

Flow Diagram Produksi α-Amilase dari Bacillus Amyloliquefaciens 1 mL inokulum dari kultur kaldu ditambahkan dedak gandum. Fermentasi selama 24 jam pada suhu 30°C Menambahkan 25 mL 20 mM bufer fosfat (pH = 7,0) selama 30 menit pada suhu 4°C dalam rotary shaker pada 150 rpm

Flow Diagram Produksi α-Amilase dari Bacillus Amyloliquefaciens Suspensi kemudian disentrifugasi pada 8000 rpm selama 15 menit pada 4°C. Hasil suspensi diisolasi dan purifikasi untuk mendapatkan enzim α-amilase Dihasilkan supernatan berupa enzim α-amilase

Isolasi Isolasi bakteri adalah proses pengambilan bakteri dari lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Isolasi Prinsip isolasi adalah memisahkan suatu mikroba  dari mikroba lainya sehingga diperoleh kultur murni Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Alat dan Bahan jarum ose dan objek gelas micrometer mikroskop kertas merang tabung reaksi pipet tetes beaker glass cawan petri Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan. oven sepirtus incubator wrapper

Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Bahan SIMA semisolid, SMA (skin milk agar) medium Nutrient Agar (NA), Nitrat Broth (NB), malachite green, starch agar (SA), simone citrat, MR-VP Broth, KOH-alfanaftol akuades, alcohol 70%, Kristal violet dan lugol’s iodine safranin etanol 96%, reagen H2O2 Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan. medium NB + NaCl sepirtus laktosa dan rafinosa reagen oksidase

Metode Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Pengambilan Sampel  Pengambilan dilakukan secara aseptis     Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alcohol 70% 2.  Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukan kedalam alumunium foil steril kemudian ditutup rapat Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Metode Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Pengambilan Sampel  Pengambilan dilakukan secara aseptis     Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alcohol 70% 2.  Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukan kedalam alumunium foil steril kemudian ditutup rapat Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Metode Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Tahap isolasi bacillus Preparasi Tahap Pemurnian dengan Metode Streak Kuadran 1.Dipilih satu koloni yang nampak terdiri satu tipe sel 2.Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan distreak pada plating NA 3. Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan NA 4.Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streak primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan streak sekunder tanpa kembali ke streak primer 5.Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streakan sekunder dan kemudian dilanjutkan streak tersier tanpa kembali ke streak sekunder dan primer 6. Plating diinkubasi pada suhu 300C selama 2x24jam. Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Metode Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Contoh Isolasi Bakteri Tanah Sampel tanah sebanyak 1 gram diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan akuades steril sebanyak 9 ml dan dikocok hingga homogeni (vortex). Setelah itu dipanaskan di dalam waterbath dengan suhu 80oC selama 10 menit dan dibuat seri pengenceran  10-3 dan 10-4 dengan cara diambil 0,1 ml dari masing-masing pengenceran lalu diinokulasikan ke dalam medium NA dengan metode surface plate. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu kamar, lalu diamati morfologi koloni dan sel bakteri Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Metode Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens Pengamatan Morfologi Koloni 1.  Pengamatan morfologi koloni dilakukan pada koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian dengan streak kuadran 2. Bentuk koloni, bentuk tepi, elevasi dan lainnya diamati. Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Metode Isolasi Bacillus Amyloliquefaciens  Uji Pewarnaan Gram 1.Dibuat ulasan bakteri pada object glass,difiksasi 2.Ditetesi dengan gram A (Kristal violet), dibiarkan selama 60 detik 3.Cuci dengan air mengalir , kering anginkan 4.Ditetesi dengan gram B (lugol’s iodine), dibiarkan selama 60 detik 5.Dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan 6.Dicuci dengan gram C (etanol 96%) setetes demi setetes sampai etanol yang jatuh berwarna bening dan jangan sampai terlalu banyak 7.Ditetesi dengan gram D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan dikering anginkan 8.Diamati di bawah mikroskop Enzim seperti amilase memungkinkan molekul-molekul untuk memutus di titik-titik tertentu. Tubuh dapat menggunakan gula sederhana yang dihasilkan untuk energi. Tanpa amilase pemecahan pati dengan cara ini, sebagian besar makanan akan tidak dapat digunakan.

Produksi Skala Industri Petri Disk Mikroorganisme diseleksi dan sterilisasi dari mikroba asing Flask Dikultur Dalam Agar Seed Fermenter Bereproduksi dan beradaptasi pada lingkungan baru. Large Fermenter Fermentor utama dimana pH, suhu dan CO2 terlarut diatur

Produksi Skala Industri Cell Removal Umumnya memakai teknik sentrifugasi Refining Mixing : Untuk produk cair Drying : Untuk produk bubuk Ship To Customer Enzim diimobilisasi dan dikemas sesuai kebutuhan

Submerged Fermentation PROSES PRODUKSI SKALA BESAR Submerged Fermentation kondisi dipelihara dalam fermenter tertutup dengan submerged cultures dimana enzim diproduksi oleh mikroorganisme dalam medium cair. Bagian dalam fermenter dilengkapi pengaduk. Kondisi Operasi : pH 6,0 ; suhu 30 °C

enzim ekstraseluler (disekresikan oleh sel ke lingkungan eksternal) PROSES PRODUKSI SKALA BESAR Pengambilan komponen tak larut (insoluble) cth: sel mikroorganisme Melakukan sentrifugasi Enzim tertinggal dalam broth Enzim dikonsentrasikan melalui penguapan, filtrasi membran atau kristalisasi Pemanenan Enzim enzim ekstraseluler (disekresikan oleh sel ke lingkungan eksternal)

PROSES PRODUKSI SKALA BESAR Bentuk Produk Padat Aplikasi tertentu memerlukan produk enzim dalam bentuk padat, sehingga bubuk enzim kasar dibuat menjadi butiran Cair Formulasi cair kadang-kadang lebih disukai karena lebih mudah digunakan.

Fungsi Enzim Alfa Amilase Sebanyak 30 % produksi enzim dunia adalah produksi enzim ini. Kedokteran Makanan Energi Farmasi

Fungsi Enzim Amilase Pankreas Pada Tubuh Mulut ketika makanan dikunyah, memecah ikatan polisakarida yang memiliki kaitan sama untuk membuat rantai molekul pati. memecah pati (karbohidrat )dan meloloskan makanan melalui sistem pencernaan.

memecah pati, menambah rasa dan mencemari adonan. Fungsi Enzim Amilase Pada Industri memecah senyawa maltosa dalam jelai, mengubahnya menjadi jelai malt, dan membantu proses fermentasi Melunakkan pati dalam kain, sehingga celana jeans dari bahan denim tidak kaku seperti papan. memecah pati, menambah rasa dan mencemari adonan.

Aplikasi di Bidang Industri Bioetanol Kertas Deterjen Ramah Lingkungan

R e f e r e n s i http://www.easybiologyclass.com/enzyme-substrate-specificity-types-classification/ http://www.sridianti.com http://kliksma.com/2014/12/fungsi-enzim-amilase.html http://www.madep-sa.com/pdf/ssf.pdf http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/15479/1/kpm-des2005-%20(6).pdf