HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau KCkT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi)

Kelompok 9 Ardian Dhani K P27241012008 Bonaventura Raka BS P27241012009 Claritta Aliefiandra S P27241012010 Deni Puspitasari P27241012012 Desi Aditya P27241012013 Desiana Dwi A P27241012014

Pengertian HPLC HPLC adalah teknik kromatografi dg alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom hingga 400 atm. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak

Jenis-jenis HPLC berdasarkan sifat fase diam (mekanisme sorpsi solut) Kromatografi Adsorbsi Pemisahan kromatografi adsorbsi menggunakan fase diam berupa silika, gel dan alumina. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Kromatografi fase terikat fase diamnya = silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Modifikasi silika adalah hidrokarbon non-polar (contoh : oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik) fase gerak = campuran metanol dg air atau dengan larutan bufer. Kromatografi penukar ion fase diam = dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak (contoh : polistiren resin ) Fase gerak = air  karena sifat ionisasinya

4. Kromatografi Pasangan ion digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran / kromatografi permiasi gel digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam = silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam 6. Kromatografi Afinitas digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks

1. Pompa (motor penggerak fasa gerak) Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor. a. Syarat : Tekanan hingga 6000 psi (400 atm) tahan korosi & tahan terhadap fasa gerak Control laju alir yang akurat , hingga 20 mL/menit Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien b. Jenis: Pompa reciprocating (torak) : aliran yang berdenyut dan teratur (konstan), ada peredam udara vol kecil (35 –400 L), tekanan > 10.000 psi Pompa Displacement (semprit) : seperti siring, aliran konstan(teratur), tak terbatas, dan tak berdenyut Pompa Pnematik : tekanan < 20.000 psi, aliran tidak teratur (konstan)

2. Injector (Pemasukkan cuplikan) tempat memasukkan cuplikan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. a. Syarat : tekanan tidak turun b. Teknik : syringe/ septum : disuntikkan melalui septum, tahan hingga tekanan 1500 psi/ 70 atm, tidak tahan dengan semua pelarut kromatografi cair, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan. stop-flow : aliran pelarut dihentikan sementara. Teknik ini digunakan karena difusi di dalam cairan kecil. loop vaive (kran cuplikan) : cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).

3. Kolom Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge. Biasanya terbuat dari stainless steel. a Fungsi : Menyaring kotoran Menjenuhkan fasa diam b. Jenis : Kolom analitik : d= 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom Kolom pengaman/guard kolom / preparatif : d= >6 mm, p =25 -100 cm , dpt digunakan pada temperatur lebih tinggi dari temperatur kamar.

4.      Detector Digunakan untuk mendeteksi adanya komponen sampel (cuplikan) di dalam eluen kolom (analisis kualitatif) dan menghitung jumlahnya (analisis kuantitatif). a. Syarat : sangat peka (sensitifitasnya tinggi) tidak banyak berderau (noise) kisar respons linier yang luas & waktu respon rendah memberi respons untuk semua tipe senyawa tidak merusak cuplikan b. jenis :     UV/Vis untuk senyawa organik, biasanya 254 nm Retraktif indeks (RI) detector Konduktifitas penukar ion Elektrokimia detector Polarografi redoks Indeks bias

5. Komputer (PC) dan Printer Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.

Fasa gerak dan fasa diam dalam HPLC Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol. Fase gerak (eluen/pelarut) a. Syarat :   Murni, tanpa cemaran, tidak kental untuk menghindari penyumbatan dalam kolom Tidak bereaksi dengan kemasan Sesuai dengan detector Dapat melarutkan cuplikan Mempunyai viskositas rendah Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

Fase diam (zat padat) b. Jenis : - interaktif - non interaktif -kepolaran (berdasar polaritas senyawa) Fase norrmal : Fasa gerak nonpolar & Fasa diam polar Fasa Terbalik : Fasa gerak polar & Fasa diam nonpolar Fase diam (zat padat) Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus diperkecil sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening. fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Skema alat HPLC

Prinsip Dasar HPLC pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya

Prinsip Kerja dan Instrumentasi HPLC

prinsip kerja dari HPLC : sampel yang akan diuji diinjeksikan dg injector ke dalam kolom Dari injector, memompa sampel ke kolom dengan tekanan tinggi. Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Dari kolom sampel kemudian akan terurai dan terpisah berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur yang menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan kepolaran afinitasnya Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan personal computer (PC) yang terhubung dengan alat HPLC.

Kegunaan HPLC untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

Kelebihan HPLC Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi. Kolom dapat digunakan kembali. Waktu analisa cukup singkat (cepat). HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar. Lebih teliti dan mudah melaksanakannya sehingga tepat dan akurat Resolusinya baik Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

Kekurangan HPLC Harganya cukup mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu Hanya bisa digunakan untuk asam organic Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi.

Terima Kasih