ISOLASI & KLONING GEN Makhziah, Ir.MP.

ISOLASI DNA DNA dlm gel agarose DNA SOLUTION

TAHAP ISOLASI dan KLONING GEN: 1. DIGESTI 2. REKOMBINASI TRANSFORMASI 4. IDENTIFIKASI 5. HIBRIDISASI KOLONI

I. DIGESTI Pemotongan DNA target menjadi fragmen DNA oleh ensim restriksi (salah satu mungkin gen target yang diinginkan)

II. REKOMBINASI PLASMID + GEN TARGET

REKOMBINASI Fragmen DNA target dan DNA vector dicampur /disambung dg ensim ligase. Terjadi 3 kemungkinan hasil: fragmen DNA target menyambung sendiri & tidak tersambung dg vector b. DNA vector menyambung kembali tanpa tersisip DNA target c. DNA vector tersisip DNA target DNA rekombinan

III. TRANSFORMASI DNA rekombinan diintroduksi/dimasukkan dlm sel inang (biasanya E. coli) SEL KOMPETEN   Vector membelah / memperbanyak diri sel inang juga membelah shg vector dan DNA rekombinan semakin banyak klon DNA REKOMBINAN

IV. IDENTIFIKASI Untuk membedakan/ menyeleksi hanya plasmid yang membawa DNA rekombinan, perlu dilakukan REPLICA PLATING, yaitu : Menguji bakteri pada media agar-agar yang diberi antibiotik ampicilin & tetrasiklin . E. coli yang tidak dimasuki plasmid akan mati karena tdk punya gen ketahanan amp R & tetr R DNA rekombinan tidak tahan thd antibiotik tetrasiklin karena DNA target memotong sekuen gen ketahan tetr R, tp DNA non rekombinan tahan, krn tetr R tidak terpotong.

PLASMID pBR 322 Tc R terpotong

REPLICA PLATING Bakteri ditumbuhkan pada media ampicilin, yg tumbuh dipindah ke media tetrasiklin, yg tidak tumbuh berarti mengandung DNA REKOMBINAN Dg membandingkan kedua media , dpt diketahui koloni mana yg mengandung DNA rekombinan, lalu dibuat MASTER PLATE Menumbuhkan koloni DNA rekombinan pd media agar yg baru 

REPLICA PLATING MASTER PLATE

V. HIBRIDISASI KOLONI Dilakukan utk membedakan DNA gen target dg yg bukan, krn diantara DNA rekombinan tdk semua membawa DNA gen target. Cara : Diatas media master plate diletakkan membran nitroselulose , tjd Difusi larutan agar2 ke membran shg bakteri tumbuh pd membran. Melalui bbrp proses DNA bakteri pd membran dicuci & didenaturasi shg menjadi utas tunggal (single strand). Hibridisasi DNA bakteri dg probe (pelacak) yg tlh terlabel, maka DNA yg terhibridisasi merupakan DNA REKOMBINAN GEN TARGET

HIBRIDISASI KOLONI

Selesai