Analisis Instrument Kromatografi Lapis Tipis (KLT) POLTEKES KEMENKES SURAKARTA 2012

Anggota kelompok : Irma Khoirunnisa P 27241012028 Irzal Fandi D P 27241012029 Khoiru Nurul H P 27241012030 Miftah Arif N P 27241012031 Monica Putri P 27241012032 Monique Putri P 27241012033

Pengertian KLT Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen menggunakan fase diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan salah satu jenis kromatografi analitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak keuntungan menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas.

Peralatan KLT Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fase diam.

Lanjutan...... Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan cara trial and error.Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.

Faktor Retensi Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen Rumus faktor retensi : jarak tempuh komponen jarak tempuh eluen

Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan Rf yg rendah.

Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8 Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya.

Cara Menggunakan KLT Alat-alat yang digunakan : Chamber (wadah untuk proses KLT) Pinset Plat KLT Dan eluen

Langkah-langkah memakai KLT Potong plat sesuai ukuran. Biasanya, untuk satu spot menggunakan plat selebar 1 cm. Berarti jika menguji 3 sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm. Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat, dan garis akhir di bagian atas.

3. Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar, tepat di atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan totolan. 4. Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam chamber dan campurkan. 5. Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh ulen. Tutuplah chamber.

6. Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana pemisahan akan terlihat. 7. Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur jarak spot. Jika spot tidak kelihatan, amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot dengan pewarna tertentu seperti kalium kromat atau ninhidrin.

Bahan dan Teknik KLT Penjerap/fase diam Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu meka-nisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT.

2) Fase gerak pada KLT Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.

Berikut beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak : Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknikyang sensitive  Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Ry solut terletak antara 0,2- 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. 

3) Aplikasi (Penotolan) sampel Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyakmakaakan menurunkan resolusi.

Lanjutan...’’ Penotolan sampel secara otomatis Penotolan sampel dalam Jumlah banyak secara manual membutuhkan waktu yang lama dan juga menghasilkan reprodusibilitas yang kurang bagus. Reprodusibilitas dan kecepatan sering dicapai dengan menggunakan penotol otomatis. Motor stepper akan mengontrol kecepatan gerakan sedotan syring; dengan demikian banyaknya sampel per bercak atau per pita dapat dikontrol. Lebih lanjut motor stepper akan menggerakkan lempeng lapis tipis pada arah sumbu x. Parameter-parameter ini diprogram dan dikontrol dengan mikroprosesor.

ada beberapa teknik pengembangan,yaitu: Konvensional 4) pengembangan secara otomatis ada beberapa teknik pengembangan,yaitu: Konvensional Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik (ascending], yang mana ujung bawah lempeng diceiup-kan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan repro dusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak (chamber] harus dijenuhkan dengan uap fase gerak. Jarak pengembangan fase gerak biasanya kurang lebih 10-15 cm; akan tetapi beberapa ahli kromatografi memilih me ngembangkan lempeng pada jarak 15 - 20 cm. Untuk lempeng KLT-kinerja tinggi (HPTLC), yang mempunyai ukuran partikel !e-bih kecil, maka pengembangan lempeng dilakukan pada jarak antara 3-6 cm.

Pengembangan 2 dimensi KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkat-kan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mem punyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rjuga hampir sama, sebagaimana dalam sampel asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda da-pat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama.

KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penoto-lan sampel di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan eluen pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dipindahkan dari chamber pengembang dan eluen dibiarkan menguap dari lempeng. Selanjutnya, lempeng dimasukkan dalam chamber yang meng-gunakan eluen kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Suksesnya pemisahan tergantung pada kemam-puan untuk memodifikasi selektifitas eluen kedua dibanding- kan dengan selekifitas eluen pertama'9'.

Pengembangan kontiyu Pengembangan kontinyu (pengembangan terus menerus) dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara terus-menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan, dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan.

Pengembangan gradient Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan kom-posisi fase gerak yang berbeda-beda. Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam bejana dan diaduk sampai homogen.

5) Deteksi Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang ti-dak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisi-ka, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan de ngan fluoresensi dibawah sinar ultraviolet.

Fluoresensi dengan sinar ultraviolet, terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi, akan membuat bercak terlihat lebih jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluo resensi, maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluore sensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam karena menyerap sinar ultraviolet sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresen si. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak.

Kekurangan KLT kerja penyaputannya, pelat kaca dengan penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan adanya penyaput otomatis. Meskipun begitu, dengan menggunakan alat itu pun tetap diperlukan tindakan pencegahan tertentu.

TERIMA KASIH.....