Diagnosis Molekuler & Terapi Gen Purnomo Soeharso Departeme Biologi Medik FKUI

Diagnosis Molekuler : Menggunakan teknik biologi molekuler untuk mendapatkan informasi tentang etiologi penyakit, mengidentifikasi kerentanan individu untuk mendapat penyakit tertentu dan menentukan diagnosis/ prognosis penyakit berdasarkan analisis DNA atau hasil ekspresinya.

Prinsip Kerja : - mendeteksi kelainan/penyimpangan atau status patologi individu (pasien). - menggunakan sampel DNA atau hasil ekspresinya (RNA & protein) untuk mendapatkan informasi dan menegakkan diagnosis. - menggunakan hasil uji/deteksi molekuler tersebut untuk diagnosis, klasifikasi, prognosis dan memantau respon terapi /perjalanan penyakit.

Keutamaan (pentingnya) diagnosis molekuler : - informasi biologi molekuler (DNA dan hasil ekspresinya) menjelaskan berbagai aspek medik atau klinik penyakit, kelainan atau penyimpangan. - penemuan-penemuan terbaru teknik biologi molekuler memungkinkan pengertian/interpretasi yang mendalam tentang penyakit dan kelainan pada tingkat molekul. - pengertian/interpretasi yang mendalam tentang penyakit dan kelainan diimplementasikan untuk uji diagnostik, terapi, pemulihan dan pencegahan

Tujuan : - mendapatkan konsep esensial (penting) yang bermanfaat untuk identifikasi marka (penanda) molekuler penyakit. - mengaplikasikan (menerapkan) uji molekuler untuk memantau penyakit, menentukan strategi penanganan /pengelolaan penyakit dan mengantisipasi akibat /hasil penanganan suatu penyakit.

Sejarah perkembangan biologi molekuler & implikasinya pada diagnosis molekuler Gregor Mendel, Law of Heredity 1866 Johann Miescher, Purification of DNA Recombinant DNA Technology 1977 DNA sequencing 1985 In Vitro Amplification of DNA (PCR) 2001The Human Genome Project Watson and Crick, Structure of DNA Sickle Cell Anemia Mutation 1949

Metodologi Langkah-langkah yang diambil dalam diagnosis molekuler : 1. isolasi /ekstraksi DNA genom atau RNA dari sel 2. identifikasi DNA atau hasil ekspresinya (RNA & protein) : PCR, hibridisasi blot Southern, Northern, Western 3. karakterisasi gen : sikuensing, RFLP, gene cloning, dll. 4. analisa kualitatif : patologi, mutasi, polimorfisme, dll analisa kuantitatif : konsentrasi DNA/RNA/protein 5. kesimpulan

Diagnosis penyakit :  infeksi : - mendeteksi DNA/RNA bakteri, virus atau parasit - mengidentifikasi genotip bakteri/virus/parasit - mendeterminasi mutasi bakteri/virus/parasit - menguji resistensi bakteri/virus/parasit terhadap antibiotik  degeneratif - mengidentifikasi gen kausatif - mendeterminasi mutasi atau polimorfisme gen tsb - menganalisa hambatan atau malfungsi gen tsb

 Keganasan - mengidentifikasi marka (penanda) keganasan - onkogen, virus, gen spesifik - mendeterminasi perubahan – mutasi, delesi, translokasi gen marka keganasan - menguji suseptibilitas individu terhadap keganasan - genetika dan silsilah keluarga

Kelainan atau penyimpangan :  genetika - mengidentifikasi gen kausatif atau marka - mendeterminasi perubahan gen kausatif - mendeterminasi genotip individu ybs - menganalisa pedigree (silsilah keluarga) ybs  malformasi kongenital - mengidentifikasi gen kausatif atau marka - mendeterminasi perubahan gen kausatif

Contoh : Diagnosis penyakit infeksi – hepatitis B Hepatitis B disebabkan oleh infeksi virus hepatitis B (VHB), menyebabkan infeksi akut dan/atau khronik. Infeksi akut ditandai dengan viremia dan kerusakan hati, sedangkan infeksi khronik ditandai viremia menetap dengan titer bervariasi, asimptomatik dan kambuh pada waktu2 tertentu. Diagnosis ditegakkan dengan mendeteksi DNA VHB dalam serum dengan PCR secara kualitatif dan kuantitatif, identifikasi genotip virus secara serologi atau PCR.

Diagnosis penyakit keganasan (kanker) – karsinoma nasofaring (KNF) Karsinoma nasofaring (KNF) adalah keganasan yang konsisten dengan infeksi virus Epstein Barr (EBV). Pada epitel nasofaring replikasi EBV ditandai dengan ekspresi gen litik virus immediate early BRLF1 dan BZLF1. Kedua gen ini berfungsi menginduksi fase litik tahap early dan late. Expresi gen litik (BRLF1 dan BZLF1) secara spesifik ditemukan pada jaringan tumor primer penderita KNF. Deteksi mRNA gen litik EBV padajaringan tumor KNF mencerminkan patogenesis KNF. Pengukuran mRNA gen litik EBV secara kuantitatif dari biopsi tumor dapat memberi informasi tentang progresifitas KNF.

← 142 bp ← 157 bp (a) Ekspresi mRNA LMP1 (positivitas 91,3 %) (b) Ekspresi mRNA BRLF1 (positivitas 65,2 %) Hasil RT-PCR LMP1 & BRLF1 Positivitas ekspresi mRNA LMP1 & BRLF1 > 65 % (Niedobitek, 2000)

Diagnosis penyakit degeneratif  infertilitas pria Salah satu penyebab infertilitas pria adalah inefektifitas hormon gonadotropin FSH dan testosteron pada sel target yaitu sel sertoli dan sel-sel germinal dalam tubulus seminiferus. Inefektifitas dapat disebabkan karena ketidak sempurnaan reseptor hormon tersebut pada sel target karena mutasi atau variasi alotip yang menyebabkan afinitas hormon terhadap reseptornya menurun. Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi reseptor FSH dan androgen dengan PCR dilanjutkan dengan deteksi mutasi dengan sikuensing DNA dan determinasi genotip/alotip gen reseptor FSH dan androgen dengan RFLP.

Hasil Penelitian Gambar 1. Hasil PCR gen reseptor FSH yang meliputi kodon 307 dan 680 exon 10. (E = endometriosis; N = normal)

Gambar 2a. Hasil SSCP gen reseptor FSH yang meliputi kodon 307 exon 10. Keterangan : 1 = AT, 2 = TT, 3 = AT, 4 = AA, 5 = TT, 6 = AT, 7 = AT, 8 = TT, 9 = TT, 10 = TT ( A = alanin; T = threonin )

Gambar 2b. Hasil SSCP gen reseptor FSH yang meliputi kodon 680 exon 10. Keterangan : 1 = NS, 2 = SS, 3 = NN, 4 = NS ( N = asparagin; S = serin )

Hasil SSCP untuk mendeterminasi jumlah pengulangan CAG pada gen reseptor androgen dengan jangkauan antara 19 ulangan (no. 15) dan 31 ulangan (no. 20) PCR-SSCP pengulangan CAG gen reseptor androgen

Diagnosis penyakit genetika – anemia sel sabit (sickle cell anaemia) Anemia sel sabit adalah penyakit genetika disebabkan karena mutasi titik sehingga asam amino ke 6 dari hemoglobin β berubah dari glutamat menjadi valin (GAG  GTG). Mutasi mengubah gen menjadi alel yang kodominan. Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi gen hemoglobin β dengan PCR dan deteksi mutasi kodon 6 dengan sikuensing DNA. Distribusi alotip dalam keluarga dideterminasi dengan analisa pedigree.

Kelebihan diagnosis molekuler : - lebih efisien dalam metodologi, waktu dan sampling - lebih cepat dan akurat - memerlukan sampel dengan jumlah atau ukuran kecil - dapat disimpan dan diulang kembali dalam rentang waktu lama Kelemahan/kekurangan : - memerlukan metodologi dan sarana yang kompleks & mutakhir. - biaya operasional mahal - hanya dapat dilakukan dilaboratorium yang komplit

Terapi gen : Menginsersikan gen normal (sehat) ke sel/jaringan individu yang menderita penyakit genetika resesif agar gen yang diinsersikan dapat mengganti/ mengkompensasi atau mengkoreksi fungsi gen yang tidak atau kurang berfungsi. Terapi gen sel somatik (somatic cell gene therapy) lebih diprioritaskan daripada germline cell therapy – gen asing yang diinsersikan tidak diturunkan ke generasi berikutnya  tidak berlawanan dengan etik.

Metodologi Menginsersikan gen/DNA ke galur sel (cell line) tertentu - Microinjection dengan microneedle glass menggunakan micro manipulator  dilakukan pada in vitro fertilization (ICSI). - Penggunaan karier loposom (lipofection): DNAdicampur dengan fosfolipid yang dapat membentuk kapsul lipid bilayer sintetik (liposom)  liposom yang membawa DNA ditambahkan ke kultur sel  terjadi fusi liposom – membran sel & DNA masuk ke dalam sel, beberapa mencapai nukleus, berintegrasi dengan DNA genom & diexpresikan.

Transfeksi gen dengan virus DNA manusia (asing) di klon pada DNA SV40 yang membawa promoter & ditransfeksikan ke COS cell line (cell line ginjal kera). Sel COS yang terinfeksi mati & membentuk virion baru yang membawa DNA rekombinan sebagai DNA genomnya. Virion diinfeksikan ke kultur sel baru  beberapa sel inang mengadopsi DNA & terintegrasi ke DNA genom & diexpresikan.

Contoh terapi gen pada leukemia limfositik / mielositik : Transfesikan gen normal ke stem cell penderita leukemia yang diambil dari bone marrow. Bersihkan bone marrow & tanamkan stem cell yang membawa gen normal rekombinan  sel normal tumbuh menggantikan sel leukemia.

Terima Kasih atas Perhatian Anda