DNA mengandung informasi The human genome contains 3x109 base pairs Assuming that 3000 bases would fit on one page, 1000 books with 1000 pages each are necessary to comprise the human genome information of 3x109 letters. If you would compare the human genome with a library where books are found with 3000 letters on each side, you would need 1000 books containing 1000 pages to represent the information.

PCR Technology PCR = Polymerase Chain Reaction Enzyme based site directed amplification of nucleic acids Developed by Kary Mullis (USA) in 1985 Awareded with the Nobel-price Kegunaan utama dari PCR adalah untuk menggandakan sebuah bagian spesifik dari DNA (misal sebuah gen) hingga berkali² lipat (amplifikasi) sehingga bagian spesifik DNA yang kita inginkan dapat kita identifikasi dan diketahui keberadaannya. The Polymerase chain reaction is an enzyme based site directed amplification of nucleic acid. This technology was developed by Karry Mullis in 1985 and awarded with the Nobel-price.

Apakah Metoda PCR ? Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target. Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

PCR : proses amplifikasi Tahapan Proses PCR Pre – PCR : Preparasi reagensia Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA PCR : proses amplifikasi Denaturasi (pemisahan rantai DNA) Annealing (penempelan primer) Extension (pemanjangan oleh enzim) Post – PCR : Deteksi/ Analisa Hasil PCR

PRE-PCR Preparasi spesimen : isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi. Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses : Penghancuran dinding sel Penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel Pengendapan DNA/RNA Pemanenan

Preparasi spesimen : isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dengan Metode Phenol Isolasi DNA Isolasi RNA

Berikatan dengan “glass fleece” Garam kaotropik Wash and spin Preparasi spesimen : isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dengan Metode Kolom Berikatan dengan “glass fleece” Garam kaotropik Wash and spin Pelarutan asam nukleat Analisa selanjutnya All High Pure kits have the same principle in common. You know one, you know all of them. Based on the properties of nucleic acids to adsorb to silica or glass surfaces in the presence of high concentrations of a chaotropic salt (e.g. guanidine salts, Na-perchlorate, Na-iodide,…..). Hydrate shell of NA is disturbed, thus entropy driven reaction to interact with SiO2 moieties of glass. Alcohol in wash buffer keeps NA adsorbed. With aqueous elution buffer the interaction is reversed. NA can directly be used for enzymatic reactions.

Sekuen Target DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme Target Sequence DNA Strand Double Helix DNA Strand Supercoiled DNA Strand Chromosome

Sekuen Nukleotida Hydrogen Bonds Cytosine (C) Adenine (A) Guanine (G) Thymine (T) Thymine (T) Guanine (G) Adenine (A) Cytosine (C) Deoxyribose (Sugar molecule) Phosphoric Acid (Phosphate molecule)

Pre-PCR Preparasi Reagensia : Komponen Master Mix Mg2+ and OR Taq DNA Polymerase Mn2+ rTth DNA Polymerase dCTP AmpErase® dGTP dUTP Biotinylated Primer dATP

Polymerase Chain Reaction Target DNA/RNA Mg2+ PCR AmpErase® Taq DNA Polymerase Biotinylated Primers dUTP dCTP dGTP Biotinylated Amplicon Biotinylated Amplicon dTTP dATP Master Mix

Yang diperlukan pada PCR PCR is performed in very small dimensions. In general, 20µl reaction volume is sufficient. The components of the reaction mixture are DNA, a specific enzyme, derived from heat-resistant bacteria, artificial PCR-primers, the letters of the genetic code called nucleotides and buffer conditions, allowing the reaction to take place. The process itself requires several temperature steps. Nowadays, thermal cyclers are available, which perform the heating and cooling of the reaction mix automatically. In the following pages the thermal core process and the subsequent PCR reaction is explained.

PROSES PCR : Amplifikasi 1 – Denaturasi oleh panas Target Sequence Target Sequence

2 – Annealing Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung Sekuen Target Target Sequence 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ Target Sequence

3 – Ekstension Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai Komplemen Nukleotida Target Sequence 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Taq DNA Polymerase Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ Target Sequence

Akhir Siklus PCR ke-1 Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target Target Sequence Biotin Biotin Target Sequence

Target Amplifikasi : Siklus PCR diulang No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon

Deteksi/ Analisa Hasil PCR Elektroforesis gel agarosa (horizontal) Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal) Enzym labelling oligonucleotide Biotin-labelled oligonucleotide Digoxigenin-labelled oligonucleotide Sequencing

Deteksi Produk PCR: Elektroforesis Gel agarosa

Applikasi PCR 1. Isolation of genomic DNA PCR memungkinkan pengisolasian fragmen DNA dari DNA genomic secara amplifikasi selektif dari area DNA spesifik. 2. Pengunaan PCR meningkatkan beberapa metoda seperti Southern and northern blotting dan DNA cloning, yang membutuhkan sejumlah banyak DNA yang melambangkan are DNA spesific. 3 Aplikasi lain PCR termasuk DNA sequencing untuk menetukan urutan dari DNA yang sudah diamplifikasi. 4. Isolasi dari urutan DNA memungkinakan tehnologi baru yaitu DNA rekombiann. 5. DNA rekombinan yaitu menyisipkan suatu urutan DNA kedalam plasmid atau materi genetik pada organisme lain. 6. PCR juga digunakan untuk penetuan sidik jari pada bidang forensik untuk mengindentifikasi orang atau organisme dan membandingkannya dengan peta DNA.

Aplikasi dan perkembangan molekuler Aplikasi bioteknologi modern adalah bioteknologi biomolekuler yang telah memanfaatkan pengetahuan genetika dan kloning, atau secara umum disebut rekayasa genetika, seperti : 1. Mutasi buatan : yaitu mutasi yang ditujukan untuk merubah susunan gen, sehingga sifat yang diturunkan pun berubah. Mutasi buatan ini umumnya menggunakan radiasi, contohnya : padi var. Atomita I dan II, kedelai var. Muna. 2. Transplantasi gen / Penyisipan gen / Teknologi Plasmid: yaitu penyisipan gen organisme satu ke genom organisme lain, dengan tujuan untuk produksi suatu senyawa dalam skala besar dan cepat, untuk terapi medis, atau untuk mengatasi masalah lingkungan. 3. Hibridoma : yaitu teknik pencangkokan sel dengan materi genetik dari sel yang lain, yang umumnya digunakan untuk terapi medis kekebalan tubuh (imunoterapi) dan kanker. Contohnya pemasukkan genom penghasil antibodi dari sel limfosit, kedalam sel kanker yang sangat cepat berploriferasi, sehingga sel kanker tersebut dapat menghasilkan antibodi dan dapat melawan sel kanker lainnya atau zat asing yang masuk ke dalam tubuh dengan cepat, yang secara normal tidak bisa diatasi oleh antibodi dari sel limfosit saja. 4. Kloning : yaitu teknik perbanyakan sel, jaringan atau organisme secara aseksual, bias melibatkan dua induk atau satu induk.

Adapun teknik rekayasa genetika yang umum dilakukan adalah sebagai berikut : A. Perbanyakan (Pengklonan) DNA Kloning DNA umumnya adalah perbanyakan DNA rekombinan, yaitu DNA yang sudah direkayasa dengan teknik penggabungan/penyisipan gen (DNA) dari organisme satu ke dalam genom organisme lain (transplantasi gen/teknologi plasmid). Contohnya : kloning gen penghasil insulin dari kelenjar pankreas manusia, disisipkan ke dalam plasmid bakteri Escherichia coli, sehingga bakteri dapat mengekspresikan gen tersebut dan menghasilkan insulin manusia dalam jumlah yang banyak, mengingat bakteri sangat cepat membelah diri dan bertambah banyak dengan cepat. Mekanisme Penyisipan Gen/DNA : 1. DNA yang ingin disisipkan, diisolasi dan dipotong oleh enzim endonuklease restriksi, ditempat yang urutan nukleotidanya spesifik. 2. DNA yang akan digunakan sebagai inang, misalnya plasmid bakteri E. coli, diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama. Plasmid ini biasanya disebut sebagai vektor pengklon. 3. Fragmen DNA kemudian disisipkan ke dalam vektor dan disatukan oleh enzim endonuklease ligase. 4. Plasmid yang telah disisipi, dimasukkan kembali ke dalam bakteri, kemudian bakteri tersebut dikembangbiakan menjadi banyak, sehingga rekombinan pun ikut bertambah banyak, demikian pula hasil ekspresi gennya (Gambar 1).

B. Kloning Gen Eukariotik dalam Plasmid Bakteri Pengekspresian gen eukariot di dalam ruang lingkup gen prokariot sangatlah sulit, karena kedua gen tersebut susunannya berbeda, selain itu adanya daerah bukan pengkode (intron) di dalam DNA eukariotik yang cukup panjang, dapat mencegah ekspresi gen yang benar oleh sel prokariot.Untuk mengatasi hal tersebut, maka ketika enzim restriksi memotong DNA eukariot, dibagian hulu fragmen DNA tersebut harus disisipi oleh promoter prokariot. Pada saat gen eukariot disisipkan, bakteri dapat mengenali promoter, dan langsung mengekspresikan gen tersebut. Untuk hal yang kedua, bisa diatasi dengan merubah mRNA menjadi DNA komplementer (‘complementary DNA’/cDNA), menggunakan enzim transkriptase balik (‘reverse transcriptase’), yaitu enzim yang diisolasi dari retrovirus. mRNA bisa digunakan karena pada mRNA, intronnya telah dikeluarkan pada saat proses ‘splicing’ . Setelah DNA ditransplantasi menghasilkan DNA rekombinan, maka DNA tersebut harus dimasukkan kembali ke dalam inang, supaya bisa berekspresi. Pemasukkan DNA rekombinan bisa dengan cara elektroporasi (memberikan kejutan listrik untuk membuka membran sel), atau dengan cara penyuntikan (mikroinjeksi), atau dengan cara transformasi, yaitu penyerapan DNA rekombinan dari larutan.

C. Kloning DNA secara In Vitro Pengklonan DNA di dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk mempersiapkan gen tertentu dalam jumlah banyak. Namun ketika sumber DNA sangat sedikit dan tidak murni, maka dapat digunakan metode PCR (‘Polymerase Chain Reaction’), sehingga setiap fragmen DNA dapat disalin beberapa kali dengan cepat dan diperkuat (amflipikasi) tanpa menggunakan sel. Mekanisme PCR dapat dilihat pada gambar 3. Adapun yang dibutuhkan dalam PCR ini adalah enzim DNA polimerase yang tahan panas, potongan DNA untai tunggal sebagai primer, dan pasokan nukleotida. Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan dalam penelitian biologis kedokteran, sosial, dan hukum. Contohnya : PCR digunakan untuk memperkuat DNA gajah purba (Mamoth), yang telah berusia 40.000 tahun, PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku kejahatan dari sampel DNA air mani, darah atau jaringan tubuh pelaku lainnya, atau PCR ini digunakan untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi, seperti DNA virus HIV.