Enzim Pangan Hasil Ternak-S1 KINETIKA ENZIM Enzim Pangan Hasil Ternak-S1

Km & Vmax Km dan Vmax berhubungan dengan kinetika enzyme dlm sistem biologis Km merupakan substrate concentration yang diperlukan untuk terjadinya suatu reaksi pada 1/2 Vmax. = Seberapa substrate yang diperlukan untuk terjadinya reaksi pd 1/2 V max.

Km Km : binding affinity. Km >  Afinitas binding < Jika Km <  diperlukan [S] yg lebih sedikit untuk bekerjanya enzim: Enzim sesuai dg S nya E mengikat S kuat. Km>  diperlukan [S] lebih banyak untuk bekerjanya E

Competitive inhibitor Km : the affinity for the enzyme to the substrate. In competitive inhibition : ada senyawa lain selain S yg berikatan dg sisi aktif E. Sbl ada Inhibitor: E mudah berikatan dg S. Jika ada S & Inhibitor E lebih sedikit mendapatkan S aslinya, krn E dpt berikatan dg Inh juga, berarti affinity for the substrate turun  artinya Km value naik Km increases with a competitive inhibitor: karena inhibitor scr langsung berkompetisi dg S untuk berikatan dg sisi aktif E Km increases. Jika ada Inhibitor comp perlu [S] >> , untuk memperoleh the same 1/2 Vmax ( Km increases).

Noncompetitive inhibitors Vmax decreases with a noncompetitive inhibitor: karena inhibitor tdk berikatan pd active site. Inhibitor binds allosterically  tdk berkompetisi scr langsung. Noncompetitive inhibitors mengikat sisi lain selain sisi aktif E Sisi aktif mjd kacau karena ikatan inhibitor konformasi E berubah  kunci & gembok tdk fit lagi Jika tidak fit Vmax akan turun

Pengujian Aktivitas Enzim Protease 3 tabung reaksi Tabung sampel: 1 ml S kasein + 0,2 ml E Tabung Standar: 1 ml S kasein + 0,2 ml tirosin (lart Tirosin 5 mmol/ml) Tabung blanko : 1ml S kasein + 0,2 ml aquadest Inkubasi 10 mnt suhu 37oC Tambahkan 2 ml TCA pd tiap tabung di atas T. sampel + 0,2 ml aquadest T standar + 0,2 ml E T blanko + 0,2 ml E Inkubasikan pd suhu 37oC 10 mnt  sentrifugasi 4000 rpm 10 mnt  ambil supernatan 1,5 ml

Diapkan 3 tabung baru Setiap tabung diisi supernatan 1,5 ml Tambahkan 5 ml Na2 CO3 dan 1 ml pereaksi Folin Inkubasikan 20 menit pada suhu 37oC Baca Abs pd λ 578 nm (Bergmeyer & Grass, 1983)

Isolasi Enzim Bromelin Batang nanas yang telah dihaluskan diambil filtratnya kemudian ditambahkan bufer fosfat 0,1 M pH 7. Untuk memisahkan bagian-bagian yang tidak larut yang masih ada di dalam filtrat disentrifugasi 3500 rpm 15 menit pada suhu 4 °C. Diperoleh filtrat yang mengandung ekstrak kasar enzim bromelin

Penentuan Km dan Vmaks Penentuan Km dan Vmaks pd E bromelin dilakukan dengan cara Menentukan aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi substrat kasein yaitu 2, 4, 6, 8, 10, dan 12 mg/ml Harga Km dan Vmaks ditentukan dari grafik antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi yang telah ditransformasikan ke dalam persamaan Lineaweaver-Burk.

Penentuan nilai Km dan Vmax pada beberapa level substrat ekstrak kasar misal 3, 6, 9, 12, 15 dan 18%. Reaksi antara E dan substrat dilakukan pada pH, suhu dan menggunakan waktu inkubasi optimum

Penentuan Kadar Protein Kadar protein ditentukan dengan metode Biuret pada λ 520 nm dan sebagai standar digunakan larutan bovine serum albumin (BSA) dengan variasi konsentrasi

Optimasi suhu Aktivitas enzim 0 20 40 60`` 80 oC

Optimasi pH Aktivitas enzim 0 2 4 6 8 10 pH

Aktivitas bromelin pd berbagai [S] Konsentrasi Substrat (mg/ml) Aktivitas Enzim (U/ml) 2 4 6 8 10 12 0,187 0,304 0,363 0,398 0,434 0,477

Hasil transformasi persamaan Michaelis-Menten ke persamaan Lineweaver-Burk untuk menentukan harga KM danVmaks Y=ax+ b Y=7,6128x+ 1,5003 1/[v] 3 2 1 - 0.4 - 0.2 0 0.2 0.4 1/[S]

Reaksi SP yg dikatalisis E v M Nmol/liter/menit 6,25x 10-6 15,0 7,50x 10-5 56,25 1,00x10-4 60 1,00x10-3 74,9 1,00x10-2 75 Berapa V maks & Km ???

V mjd tidak sensitif thd perubahan [S] pd konsentrasi di atas 10 -3 – 10 -2 M Kisaran 10 -3 – 10 -2 M mendekati Vmaks V maks = 75 nmol/liter/menit

Km??? 60 Km = 2,5 x 10-5 Diambil salah satu v dengan S yang sesuai v/Vmaks = [S] Km + [S] 60 = 10-4 75 Km + 10-4 75x10-4 = 60 Km + 60 x 10-4 Km = 15 x 10-4 = 0,25 x 10-4 60 Km = 2,5 x 10-5 Velocity = V = V maks [S] [S] + KM

Soal……..lanjutkan!!! Berapa v pada saat [S] = 2,5 x 10-5 M dan pada saat [S] = 5,0 x 10-5 M Berapa v pada saat saat [S] = 5,0 x 10-5 M dan jika [E] dua kali?? Berapa v (produk yang terakumulasi ) setelah periode 10 menit????

V secara langsung proporsional dengan [E] pada semua [S]