III. TEKNIK ASEPTIK Salah satu pembatas keberhasilan Kuljar adalah kontaminasi - Kontaminasi dapat berasal dari : * Eksplan baik internal maupun eksternal * Organisme kecil yang masuk ke dlm media, mis semut dsb. * Botol kultur. Alat tnm yang kurang steril * Lingk kerja dan ruang kultur yang kotor * Kecerobohan dlm pelaksanaan III. TEKNIK ASEPTIK Salah satu pembatas keberhasilan Kuljar adalah kontaminasi - Kontaminasi dapat berasal dari : * Eksplan baik internal maupun eksternal * Organisme kecil yang masuk ke dlm media, mis semut dsb. * Botol kultur. Alat tnm yang kurang steril * Lingk kerja dan ruang kultur yang kotor * Kecerobohan dlm pelaksanaan

Dengan keadaan sumber kontaminasi spt di atas maka prosedur aseptik yang hrs dilalui yaitu : 1. Sterilisasi lingkungan kerja 2. Sterilisasi alat2 dan media 3. Sterilisasi bahan tanam 1. Sterilisasi Lingkungan Kerja - Sebelum mulai bekerja permukaan tempat kerja (laminair air flow) dilap dgn kapas yang telah dicelup alkohol 70%.

-Sebelum tanam Lampu UV yang ada Di LAF dinyalakan antara ½- 1 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja - Sehabis kerja permukaan kerja (LAF) dibersihkan dgn alkohol 70% atau menyalakan lampu UV ½- 1 jam. 2. Sterilisasi Alat dan Media - alat2 yang akan digunakan hrs disterilkan lebih dahulu, alat logam dan gelas distrilkan di autoclav.

- Pinset dan gunting disterilkan dgn pembakaran/pemanasan, untuk scalpel gagangnya dpt disterilkan dgn pemanasan, namun pisaunya jangan dipanaskan dlm suhu tinggi ttp sterilisasi dgn mencelupkan dalam alkohol - Alat2 yang perlu distrelisasi sebelum tanam adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petridish, botol kosong, jarum, pipet. - Pinset dan gunting disterilkan dgn pembakaran/pemanasan, untuk scalpel gagangnya dpt disterilkan dgn pemanasan, namun pisaunya jangan dipanaskan dlm suhu tinggi ttp sterilisasi dgn mencelupkan dalam alkohol - Alat2 yang perlu distrelisasi sebelum tanam adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petridish, botol kosong, jarum, pipet.

-Aluminium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, krn uap tdk dpt masuk kedlm pembungkus - suhu yang digunakan untuk sterilisasi C pada tek 17.5 psi (pounds per square inch) selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tek yang diinginkan tercapai - Autoclav yang digunakan bermacam-macam, mulai sederhana sampai yang programable. - Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, suhu dan tekanan autoclav diturunkan perlahan- lahan dalam waktu menit.

- Media dan aquades disterilkan dalam autoclav, untuk aquades dimasukkan wadah kecil mis erlemeyer 250 ml dgn diisi aquades maksimum 100 ml. Sterilisasi untuk aquades sama dgn alat-alat yaitu 1 jam pada tek 17,5 psi. - Sterilisasi media di lakukan dlm autoclav pada suhu 121 C tek antara 15-17,5 psi dgn waktu menit tgt dr volume wadah dan volume media. - Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi sdh tercapai, autoclav tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak, sebab cairan akan meluap dan tumpah - Media dan aquades disterilkan dalam autoclav, untuk aquades dimasukkan wadah kecil mis erlemeyer 250 ml dgn diisi aquades maksimum 100 ml. Sterilisasi untuk aquades sama dgn alat-alat yaitu 1 jam pada tek 17,5 psi. - Sterilisasi media di lakukan dlm autoclav pada suhu 121 C tek antara 15-17,5 psi dgn waktu menit tgt dr volume wadah dan volume media. - Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi sdh tercapai, autoclav tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak, sebab cairan akan meluap dan tumpah

- Botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang sdh dicuci bersih dipergunakan sebagai wadah disterilkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada suhu C. Setelah disterilkan langsung dpt digunakan. 3. Sterilisasi bahan Tanam - Bahan tanam dr lapang mengandung debu, kotoran,cendawan, bakteri, serangga dan telornya, tungau dan spora. - Jika kontaminan tidak dihilangkan maka dgn cepat botol kultur akan dipenuhi kontaminan - Botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang sdh dicuci bersih dipergunakan sebagai wadah disterilkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada suhu C. Setelah disterilkan langsung dpt digunakan. 3. Sterilisasi bahan Tanam - Bahan tanam dr lapang mengandung debu, kotoran,cendawan, bakteri, serangga dan telornya, tungau dan spora. - Jika kontaminan tidak dihilangkan maka dgn cepat botol kultur akan dipenuhi kontaminan

- Kontaminan dpt terjadi juga secara internal, terutama bakteri. Kontaminan yang demikian sterilisasinya sulit, hrs diberi perlakuan antibiotik ataupun fungisida. - Dalam sterilisasi bahan tanam, yang penting bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminasi hrs dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Hal ini akan menyulitkan prosedur standar didalam sterilisasi. - Setiap bhn tanam hrs ditentukan melalui percobaan pendahuluan. - Kontaminan dpt terjadi juga secara internal, terutama bakteri. Kontaminan yang demikian sterilisasinya sulit, hrs diberi perlakuan antibiotik ataupun fungisida. - Dalam sterilisasi bahan tanam, yang penting bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminasi hrs dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Hal ini akan menyulitkan prosedur standar didalam sterilisasi. - Setiap bhn tanam hrs ditentukan melalui percobaan pendahuluan.

Setiap bahan tanam mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda, tergantung dari : - Jenis tanaman - Bagian tanaman yang dipergunakan - Morfologi permukaan, mis: berbulu atau tidak - Lingkungan tumbuhnya - Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau) - Umur tanaman - Kondisi tanaman (sakit/sehat) Setiap bahan tanam mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda, tergantung dari : - Jenis tanaman - Bagian tanaman yang dipergunakan - Morfologi permukaan, mis: berbulu atau tidak - Lingkungan tumbuhnya - Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau) - Umur tanaman - Kondisi tanaman (sakit/sehat)

Kisaran konsentrasi dan lama waktu perendaman Kisaran konsentrasi dan lama waktu perendaman Bahan KonsentrasiLama perendaman Kalsium hipoklorit Natrium hipoklorit Hidrogenperoksida Gas klorin Perak nitrat Merkuri klorid Betadine Benlate Antibiotik Alkohol 1 – 10 % 2% 3 – 10 % - 1 % 0,1- 0,2 % 2,5- 10% 2 gram/l 50 gram/l 70 % 5 – 30 mnt mnt 5 – 15 mnt 1 – 4 jam 5 – 30 mnt mnt mnt mnt ½ - 1 jam ½ - 1 mnt