Metode Mikrobiologis-2

8. Enumerasi mikrobia Total counts Viable count Berat kering Breed slide method Petroff-Houser chamber Haemocytometer Viable count Spread-plate technique Pour-plate technique Filtration MPN (Most Probable Number) Berat kering Spectrophotometric

Breed’s Slide method Sejumlah volume (0,1 ml) sampel dibuat preparat smear di atas gelas benda dengan luas tertentu (1 x 4 cm2) Difiksasi, lalu diwarnai dan dikeringkan Diamati di bawah mikroskop cahaya Densitas bakteri (sel/ml) = (As x N)/(Af x V) N: jumlah rerata sel/bidang pandang (sel) As: Luas area smear (As = 400 mm2) Af:: Luas bidang pandang (mm2) V: volume sampel (ml) DF: (dilution factor) = faktor pengenceran Densitas (sel/ml) = (400 x N x)/(Af ) (x 1/10) Densitas (sel/ml) = (400 x N x)(10)/(Af ) Densitas dalam suspensi (sel/ml) = (400 x N x DF x 10)/(Af )

Total count: Petroff-Hauser Chamber

Haemocytometer

Total count: Haemocytometer Luas kotak di tengah (L1) = 1 mm2 (dibagi 25 = 1/25 mm2) Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V1) = 1mm2 x 0,02 mm = 0,02 mm3 = 0,02 x 10-3 cm3 (1 cm3 = 1000 mm3) = 2 x 10-5 cm3 (= 2/105 cm3 =2/100.000 cm3) =1/50.000 cm3 = 1/50.000 ml Contoh: Jika jumlah sel dalam kotak (L1) = 28 sel (= 28 per 1/50.000 ml) = 28 x 50.000 sel/ml = 1.400.000 sel/ml

Bidang Pandang

Luas kotak (L2) = 1/25 mm2 Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V2) = 1/25mm2 x 0,02 mm = 8 x 10-4 mm3 = 8 x 10-4 x 10-3 cm3 = 8 x 10-7 cm3 = 8 x 10-7 ml = 8/107 ml = 1/ 1.250.000 ml Contoh: Jika jumlah sel dalam kotak (L2) = 28 sel (= 28 sel per 1/1.250.000 ml) = 28 x 1.250.000 sel/ml = 35.000.000 sel/ml

Luas kotak (L3) = 1/400 mm2 Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V3) = 1/400 mm2 x 0,02 mm = 5 x 10-5 mm3 = 5 x 10-5 x 10-3 cm3 = 5 x 10-8 cm3 = 5 x 10-8 ml = 5/108 ml = 1/ 20.000.000 ml Contoh: Jika jumlah sel dalam 5 kotak (L2) = 500 sel Dalam 5 kotak L2 terdapat: 5 x 16 kotak L3 = 80 kotak L3 Maka Jumlah rerata sel per kotak L3 = 500/80 sel/(1/1.20.000.000 ml) = 6,25 sel/(1/1.20.000.000 ml) = 6,25 x 20.000.000 sel/ml

Petroff-Hausser Chamber Luas kotak terkecil (L) = 1/400 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,200 mm Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 0,200 mm3 = 1/400 x 2/10 mm3 = (1/400 x 2/10) x 1/1.000 cm3 = (2/4000) x 1/1000 cm3 = 2/4.000.000 cm3 = 1/2.000.000 ml

Haemocytometer Luas kotak terkecil (L) = 0,025 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,1 mm = 1/10 mm = 1/400 mm2 Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 1/10 mm3 = 1/4.000 mm3 = (1/4.000) x 1/1000 cm3 = 1/4.000.000 cm3 = 1/4.000.000 ml

Haemocytometer

Bidang pandang

Spermatozoa

Viable count Metode Pengenceran sample Plating pada medium padat dan diinkubasikan Hitung jumlah koloni Kerapatan mikrobia/ml sample dapat dihitung: = jumlah koloni x faktor pengenceran e.g. jika sampel yang diencerkan 10-6 x diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke dalam medium padat. Setelah diinkubasikan ditemukan sejumlah 50 koloni. Berapakah kerapatan mikrobia per ml atau gram sampel ?

Plate Count

HPC: Heterotrophic Plate Count

Persayaratan Plate Count Jumlah koloni/petridish 30 – 300, jika tidak ada yang memenuhi, dipilih ang terdekat Koloni spreader tidak dipakai Perbandingan hasil pengenceran yang berurutan: jika  2 : hasilnya direrata jika > 2 : dipakai pengenceran yang lebih kecil 4. Jika ada ulangan maka jumlah koloni direrata

Kerapatan sel (cfu/ml) Perhitungan Pengenceran Jumlah koloni/Petridish Kerapatan sel (cfu/ml) 10-4 350 280 2.800.000 10-5 25 24 300 spreader 4.300.000 62 50 250 270 2.600.000 70 80

Membran filter Kerapatan sel sangat rendah: Sejumlah volume sampel difilter Filter diletakkan di atas medium Dihitung jumlah koloni yang tumbuh Dihitung kerapatan per volume sampel N.B. Metode ini digunakan jika kerapatan mikrobia dalam sampel sangat rendah !

Metode MPN Sampel diencerkan lalu diinokulasikan ke dalam medium cair Diinkubasikan lalu di amati adanya pertumbuhan mikrobia Kerapatan dihitung berdasarkan jumlah sampel yang positif tumbuh Jumlah tabung positif di antara 5 ulangan masing2 pengenceran 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 5 4 3 Jika dipilih ; 5 4 3 dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6 maka angka MPN untuk tiap 100 gram atau ml sampel: 280 x 105/100 ml sampel Angka 280 diperoleh dari Tabel MPN (Hoskins)

Metode Berat Kering (Biomasa) Kultur mikrobia disample dengan volume tertentu (ml) Dikeringkan pada 80°C sampai beratnya konstan Kerapatan dinyatakan dengan mg-DCW/ml atau g-DCW/ml

Metode Spektrofotometri Kultur cair mikrobia diambil Dimasukkan ke dalam kuvet Dibaca nilai OD pada panjang gelombang tertentu, mis OD-600 nm OD: Optical Density

9. Karakterisasi dan Identifikasi Metode konvensional-tradisional Metode Kimiawi Metode Molekular

Characterization and Identification Identification of microorganisms can be based on various characters: Morphology: rely on morphological characters Physiology and metabolic: obtained by growing microorganisms on various media and under various growth condition Serology: based on running immunological reaction Genetic

Morphology Characteristics

Physiology and metabolic test OF TEST INDOLE TEST MICROTITER PLATE

Serological test Salmonella serological reaction

DNA Hybridization

DNA Fingerprinting