Uji Kontaminan Mikroba dalam Pangan Bakteri Coliform (samb.2) Sudrajat FMIPA UNMUL SAMARINDA TAHUN 2010 Bahan Diskusi pelatihan Pegawai BPOM Samarinda, Tahun 2010

Bakteri coliform Bentuk batang pendek, Gram negatif, aerob dan fakultatif anaerob, tidak membentuk spora dapat menfermentasi laktosa & menghasilkan gas pada suhu 32 C selama 48 jam Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter, Erwinia Bakteri indikator- berasosiasi dengan jalur intestin, keberadaannya dalam makanan – merupakan kontaminasi dari jalur intestin (feses) Uji coliform – terjadinya (re)kontaminasi & evaluasi proses sanitasi, baik pada proses pemerahan susu, setelah pasteurisasi, penyimpanan, dan proses-proses berikutnya

Presumptive test – Positive Koloni berwarna merah gelap, diameter 0,5 mm muncul setelah 24 + 2 jam inkubasi suhu 32 C pada media VRBA (violet red bile agar) Pada media 2% brilliant green lactose bile broth (BGLB) terbentuk gas setelah fermentasi 48 + 3 jam pada suhu 32 C Complete test – Positive Pada Eosin Metilen Blue (EMB) agar, 32 C, 24 jam – koloni berwarna hijau metalik Pada laktosa cair, 32 C, 48 jam – memproduksi asam dan gas Pada nutrien agar, 32 C, 24 jam - Gram negatif, batang pendek, dan tidak membentuk spora

Coliform test – pada media padat Media yang digunakan VRBA (Violet red bile agar) 1 ml sampel (atau diencerkan terlebih dahulu) dimasukkan ke dalam cawan dan ditambah 10-15 ml media yang masih mencair (atau 4 ml sampel ditambah 15-20 ml media), tergantung dari perkiraan populasi coliform Dilapisi lagi dengan media VRBA untuk mencegah pertumbuhan koloni di permukaan Inkubasi (posisi terbalik) selama 24 + 2 jam pada 32 C Koloni coliform berwarna merah gelap diameter 0,5 mm

Pemeriksaan bakteriologis meliputi : penghitungan TPC, penghitungan MPN dan Identifikasi E.coli dan penentuan Strain E.coli O157:H7 Metode pemeriksaan bakteriologi dilakukan secara: Kualitatif: - presumptive test - comfirmed test - completed test b. Kuantitatif: Total Plate Count (TPC) MPN (Most Probable Number): yaitu perkiraan jumlah kuman yang mendekati per ml /gram

A.Cara pengambilan sampel: Persiapkan wadah steril Siapkan formulir tentang lokasi pengambilan, tanggal pengambilan dan kode sampel Masukkan sampel ke dalam wadah steril tersebut Wadah diberi kode, lokasi sampling dan tanggal pengambilan sampel dengan menggunakan spidol tahan air Masukkan ke dalam box es yang telah disiapkan sebelumnya Kirim sampel ke laboratorium untuk diperiksa

B. CARA KERJA DI LABORATORIUM : (1).Persiapan sampel mikroba. Masing-masing sampel ditimbang 10 gram dimasukkan ke dalam gelas ukur, kemudian ditambahkan larutan buffer phosphat pH.7.0 hingga mencapai volume 100 ml, kemudian dikocok sampai homogen . Dengan menggunakan pipet steril, pindahkan 1 ml suspensi di atas ke dalam larutan buffer Phosfat Lakukan pengenceran sampai di dapat (pengenceran 10-1) , kemudian sebanyak 1 ml dari tiap pengenceran tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam 9 ml buffer phosphat (pengenceran 10-2), demikian seterusnya sampai pengenceran yang diinginkan.

2). Penentuan Nilai TPC Bacteria dengan Pour Plate Methods ( Metode Tuang) Metode ini bertujuan menghitung nilai Total Plate Count Bacteria /TPC ( Angka Lempeng Total/ALT) suatu bahan Prinsif : pertumbuhan bakteri pada media setelah diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam Nilai TPC ditentukan dengan cara menanam tiap contoh : a. 1 ml contoh bahan dan b. 1 ml contoh bahan dengan penipisan 1 : 101 , 10 2 dan 1 : 103 masing- masing pada lempeng nutrient secara pour plate . Hasil pertumbuhan koloni dihitung dengan quibec coloni counter dan dinyatakan dalam jumlah kuman per ml bahan.

Masing-masing pengenceran diambil 1 ml diinokulasikan pada media Nutrient Agar dengan sistem tuang, Kemudian diinkubasikan pada suhu 370 C selama 24-48 jam. Koloni yang tumbuh dihitung sebagai Total Plate Count (TPC). - Dari pengenceran 10-1, diambil 0,1 ml diinokulasikan pada media Mac Conkey agar untuk pengujian E.coli.

3).Konfirmasi untuk Coliform dan F. Sampel dari setiap pengenceran (10-1, 10-2,10-3) diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 3 tabung yang berisi lactose broth dan Brilliant Green Bile (BGB) 2%. Broth diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya gas pada tabung tersebut dan selanjutnya dihitung

4). PEMBIAKAN SAMPEL (1).Nutrien Agar (2).SS Agar (3).Mac Conkey Agar Dari tiap pengenceran di atas diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam petridish Tuangkan sebanyak 15-20 ml nutrien agar ke dalam petridish tersebut di atas Goyangkan cawa petridish sedemikian rupa sehingga sampel dan agar tercampur merata Setelah agar membeku, balikkan cawa petridish dan inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Hitung koloni yang tumbuh

(2). SS Agar Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di atas dan goreskan pada permukaan media SS Agar secara zigzag Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh Bila ditemukan koloni tidak berwarna/ bening, maka koloni tersebut tersangka sebagai Salmonella

(3). Mac Concey Agar Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di atas dan goreskan pada permukaan media MC Agar secara zigzag Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh Bila ditemukan koloni berwarna merah jambu, bulat dan besar, maka koloni tersebut tersangka sebagai E.coli

B. Metode MPN (Most Probably Number) Penentuan MPN presumptive coliform - Pada pemeriksaan ini dipakai laktosa broth - Siapkan 7 tabung reaksi yang berisi LB sebanyak 10 ml - Pipet sampel 10 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 1-5 - Pipet sampel 1 ml, lalu masukkan ke tabung 6 - Pipet sampel 0,1 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 7 - masing-masing tabung dihomogenkan - Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam - Hasil (+) dinyatakan dengan terbentuknya gas pada tabung durham dan dilanjutkan dengan tes penegasan - Hasil (-) berarti coliform negatif dan tidak perlu dilakukan tes penegasan

Prosedur pengujian total coliform dengan metode MPN (FDA, 1995)

2. Test Penegasan Dari tiap tabung yang positif pada test awal, dipindahkan 1-2 ose ke dalam tabung yang berisi 10 ml BGLB 2 %. Dari masing-masing tabung penegasan diinokulasikan ke dalam dua seri Satu seri tabung BGLB 2 % diinkubasikan pada suhu 37o C selama 24 jam untuk coliform. Satu seri tabung BGLB lainnya diinkubasikan pada suhu 44 o C selama 24 jam untuk colifecal Pembacaan dilakukan setelah 24- 48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan (+) gas. - Kemudian dicocokkan dengan tabel MPN Hoskin J.K dan hasilnya dinyatakan dalam faecal coliform /gr sampel.

Tabung positif : 5 4 1

Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. Misalkan . Diperoleh kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.