XIV. TEKNOLOGI FERMENTASI I Proses Konversi Yang Memanfaatkan TIN 321 / 2 (2-0) m.k. SATUAN PROSES XIV. TEKNOLOGI FERMENTASI I Proses Konversi Yang Memanfaatkan Teknologi Fermentasi DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

SATUAN PROSES PADA FERMENTASI Perubahan-perubahan kimia yang terjadi di dalam sel mikroba pada waktu sel tumbuh & berkembang biak Biokimia  fermentasi = aktifitas mikroba untuk memperoleh energi yang diperlukan untuk metabolisme & pertumbuhan. Fisiologi sel : pempelajari perubahan-perubahan yang terjadi di dalam sel mikroba yang berhubungan dengan perkembangan, pertumbuhan dan daur hidup mikroba Reaksi kimia penting dlm mikroba adalah reaksi oksidasi & reduksi (pelepasan & penerimaan elektron)

Teknologi Fermentasi = ilmu teknik terapan yang mendasari industri fermentasi  pemanfaatan terpadu mikrobiologi, biokimia, kimia, keteknikan, rekayasa genetika/biologi molekuler Industri Fermentasi  pemanfaatan aktifitas mikroba untuk menghasilkan berbagai produk/jasa yang berguna bagi kemaslahatan manusia

Istilah ‘fermentasi ‘berasal dari bahasa Latin= “ferfere” (to boil) untuk aktifitas khamir pada juice buah-buahan atau biji-bijian/serealia yg berkecambah (malted barley) Pengertian Fermentasi = aktifitas mikroba unutuk memperoleh energi yang diperlukan untuk metabolisme & pertumbuhannya melalui katabolisme secara anaerobik (tanpa oksigen) Secara luas : mencakup aktivitas metabolisme baik aerobik maupun anaerobik = KULTIVASI

Kelebihan Proses Fermentasi : Membuat produk yang tidak dapat, sulit atau tidak ekonomis diperoleh melalui proses kimia (enzim  reaksi spesifik) Kondisi proses lebih “lunak” (suhu ruang, tekanan atmosfir, pH netral) Efektif  biasanya laju reaksi enzimatis > reaksi kimia Bahan baku dapat diperbarui  produk bersifat lebih ramah terhadap lingkungan Dapat mengubah bahan yang murah menjadi produk yang bernilai ekonomi tinggi Contoh : pangan  aroma, tekstur, daya cerna & daya tahan simpan lebih baik

Kelemahan Proses Fermentasi : Campuran produk kompleks (camp. sel mikroba, produk, hasil samping, sisa media) proses hilir sulit Cairan fermentasi bersifat encer & produk sedikit  proses hilir mahal Resiko kontaminasi selama fermentasi Hasil beragam  sel mikroba cenderung melakukan mutasi thd perubahan lingkungan, sehingga kehilangan kemampuan berproduksi dapat hilang/menurun

METABOLISME MIKROBA Metabolisme  paduan reaksi-reaksi dimana sel menggunakan sumber-sumber bahan untuk memperoleh : - energi - blok pembangun kimiawi (dinding sel dll) - bahan-bahan dan energi untuk pemeliharaan sel, pertumbuhan, pergerakan dan reproduksi Metabolisme : a. Katabolisme (pemecahan) b. Anabolisme (biosintesis) Produk : hasil proses katabolisme atau anabolisme Media (substrat dll)  sbg sumber energi, pembentuk sel dan produk metabolisme

METABOLISME Katabolisme (pemecahan) : Menghasilkan energi dan produk metabolik/antara yang selanjutnya digunakan untuk seluruh aktivitas seluler, termasuk kegiatan biosintesis (anabolisme), kerja mekanis (motilitas) dan kerja osmotik dan elektrik (transpor nutrien) Anabolisme (biosintesis) : Penyusunan bahan sel tidak hanya dari konstituen utama ( protein, asam nukleat, lemak, karbohidrat dll) tapi juga dari senyawa antara (asam amino, purin, pirimidin, asam lemak, gula dll)  memerlukan energi

Bioelemen/intermediet KATABOLISME (Khimosintesis) ANABOLISME (Biosintesis) KATABOLISME (Fotosintesis) Sumber Energi Biopolimer Cahaya RNA, DNA, Protein Fosforilasi substrat & Oksidatif Fosforilasi Bioelemen/intermediet (asam amino, purin dll) ATP ADP ATP ADP Panas Panas Pengumpulan intraseluler Produk metabolisme Substrat Skema Proses Metabolisme di dalam Sel Mikroba

KATABOLISME Glukosa = sumber energi & sumber karbon  “Metabolisme Sentral”  glikolisis & Siklus Asam Sitrat Pada mikroba dikenal 4 jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat : Jalur Embden-Meyerhof Parnas (EMP) atau Glikolisis 2. Jalur Heksosamonofosfat (HMF) 3. Jalur Entner-Doudoroff (ED) 4. Jalur Fosfoketolase (FK)  tergantung jenis mikroba & ketersediaan substrat Piruvat  menjadi kunci dalam proses katabolisme selanjutnya, Contoh :  asam laktat, etanol (khamir) dll

Metabolisme Piruvat Secara Anaerobik Beberapa mikroba memetabolisme piruvat dengan berbagai jalur kondisi anaerobik Contoh : Mikroba Produk Utama Clostridia Asam butirat, asam asetat, butanol, etanol, aseton, CO2, H2 Enteric bacteria Asam asetat, etanol, CO2 , H2 atau asam format, (E. coli, asam laktat, asam suksinat, 2,3-butilen glikol Aerobacter aero- genes) Khamir Etanol, CO2 Homofermentatif Lactic acid lactobacilli

ANABOLISME (BIOSINTESIS) Biosintesis Asam Amino Biosintesis Asam Lemak Biosintesis Karbohidrat Biosintesis Nukleotida Biosintesis Antibiotika dll Pelajari lagi bahan kuliah Dasar Rekayasa Biokimia

KOORDINASI METABOLISME MIKROBIAL Mikroba mempunyai mekanisme metabolisme yang terkoordinasi dengan baik :  mempunyai enzim-enzim yang dibentuk dan berfungsi dengan cara terpadu, sehingga molekul-molekul terbentuk dengan proporsi tepat dan nutrien berharga tidak terbuang percuma  Mencegah “overproduction” metabolit/prekursor dan blok pembangun Contoh : metabolisme pati untuk biosintesis oleh mikroba Menjamin pada waktu tertentu hanya disintesisi enzim yang diperlukan dan dalam jumlah tepat (efisien)

METABOLISME PATI Substrat Pati Glukosa Sel Siklus Krebs C2&C3 Senyawa antara + energi Protein, DNA, RNA, mukopeptida, polisakarida, koenzim, lipida “building blocks” (asam amino, ribonukleotida, vitamin, asam organik, gula) Struktur sel (nukleus, ribosom, flagela, dinding sel, membran, mitokondria)

Penghambatan umpan balik Lintasan Biokimiawi Sederhana A ke C dapat mengalami : induksi, penghambatan umpan balik, represi umpan balik dan represi katabolit Glukosa Induksi A B C D E Represi Katabolit Enzim a Enzim b Enzim c Enzim d Penghambatan umpan balik Asam amino (bahan pembuat enzim) Represor Represi umpan balik

REGULASI METABOLISME M.o mempunyai adaptasi yang baik terhadap perubahan lingkungan  m.o dengan proses metabolisme yg lebih efisien akan menang kompetisi dengan m.o lain Mekanisme pangaturan metabolisme pada keadaan lingkungan yang berubah : 1. Adaptasi Genotip  disertai perubahan gen 2. Adaptasi Fenotip  penyesuaian dengan cara mengatur metabolismenya, sehingga tumbuh lebih efisien dalam lingkungan baru  tidak disebabkan oleh perubahan gen  cara adaptasi : dengan mengatur sintesis enzim atau aktivitas enzim

PENGATURAN METABOLIK Enzim Katabolik  diatur oleh Induksi & Pengaturan Katabolit 1. Induksi  terhadap sintesis enzim & terjadi pada tingkat gen - induksi = peningkatan relatif laju sintesis suatu enzim tertentu hanya jika ada induser (terjadi pd tk transkripsi) (= substratnya atau komponen yang serupa/analog) - Mo banyak yang dapat menggunakan berbagai sumber karbon, agar efisien m.o hanya mensintesis enzim yang dibutuhkan untuk memecahkan substrat yang ada.  induksi menjamin energi dan asam amino tidak sia-sia untuk memproduksi enzim yang tidak diperlukan

Contoh : Pemecahan laktosa oleh E.coli (substrat utama glukosa) Enzim konstitutif Laktosa glukosa Asam piruvat Enzim terinduksi Laktase : enzim terinduksi (langsung) galaktosa Glukosa-1-P (tidak langsung) Enzim konstitutif : e.g enzim pemecah glukosa diproduksi setiap saat Enzim terinduksi dibutuhkan terutama bila m.o berada dalam lingkungan media terbatas nutrien (Contoh bila E.coli ditumbuhakan pada laktosa, maka gen-gen penyandi berbagai enzim yang terlibat dalam pemanfaatan laktosa akan diekspresikan

Contoh Induser beberapa Enzim Induser Substrat Induser analog β-galaktose Laktosa Isopropil-β-D thiogalaktosa Penisilase Benzil penisilin Methisilin Maleat cis, trans isomerase Asam maleat Asam malonat Amidase alifatik Asetamida N-metilasetamida Tirosinase L-tirosin D-tirosin D-fenilalanin

Induser Produk Metabolisme Enzim Amilase Induser Produk Maltodekstrin Lipase Asam lemak Histidase Asam urokanat Poligalakturonase Asam galakturonat Induser Koenzim Enzim Piruvat dekarboksilase Induser Koenzim Thiamin

2. Represi Katabolit :  penurunan relatif laju sintesis suatu enzim spesifik, karena ada : a. Sumber karbon yang lebih dapat diasimilasi = Efek Glukosa b. Sumber Nitrogen Enzim yang aktif memecah substrat yang mengandung nitrogen dapat direpresi oleh amonia atau asam amino Contoh : - Protease Bacillus (direpresi oleh asam amino) - Nitrit/nitrat reduktase, nitrogenase, asparginase (direpresi oleh ggs amino) c. Sumber Fosfat dan Sulfur Contoh : - Fosfatase E. coli  direpresi oleh fosfat anorganik

Contoh : repressi katabolit = glucose effect) Biosintesis metabolit sekunder (diproduksi pada fase stasioner) dapat dihambat oleh substrat yang dapat dimetabolisme secara cepat oleh mikroba Produksi penisilin oleh Penicillium chrysogenum dengan menggunakan media campuran glukosa dan laktosa. Glukosa substrat yang buruk dan menghambat sintesis penisilin (dikonsumsi saat fase eksponensial/trophophase untuk pertumbuhan sel) Laktosa menyokong produksi penisilin dengan baik (fase stasioner/idiophase) Alternatif lain : glukosa diumpankan secara lambat

Enzim Biosintetik  diatur oleh Pengaturan Umpan Balik Tipe : a. Penghambatan umpan balik  terjadi pada tingkat molekuler  Metabolit akhir lintasan menghambat enzim pada awal sekuens (inhibitor = produk akhir) b. Represi Umpan Balik Pencegah pembentukan enzim  tingkat gen (a) dan (b) untuk mengatur kecepatan pembuatan produk akhir terhadap kecepatan sintesis makro molekulnya

4. Pengaturan Umpan Balik pada Jalur Bercabang Lintasan biosintesis pada umumnya adalah jalur bercabang dan menghasilkan lebih dari satu produk akhir Pengaturan umpan balik oleh salah satu produk dapat mengganggu pembentukan produk akhir lainnya, sehingga dapat mengganggu metabolisme sel.  Untuk mencegah hal tersebut m.o mempunyai mekanisme pengaturan sebagai berikut.

a. Pengaturan Diferensial oleh Isoenzim Beberapa enzim mengkatalisis reaksi yang sama dan dikontrol produk akhir yang berbeda contoh : 3 jenis enzim Aspartokinase (isoenzim) dikontrol oleh produk akhir : lisin, threonin dan metionin (E, G & H) E D A B C F G H

b. Pengaturan Umpan Balik Terpusat (Harmonis) Hanya satu enzim yang terlibat, tapi dikontrol oleh banyak produk akhir (E, G & H) dalam jumlah berlebih untuk dapat memberikan efek penghambatan atau represi (penekanan) E D A B C F G H

c. Pengaturan Umpan Balik Kumulatif (Terpadu) Produk akhir (E, G & H) bertindak sendiri-sendiri dan efek panggabungannya bersifat kumulatif terhadap penghambatan aktivitas enzim contoh: Glutamin sintetase E.coli dihambat oleh 8 jenis produk akhir A B C F G H D E

5. Pengaturan Asam Amino pada Sintesis RNA Kehabisan asam amino pada media pertumbuhan  sintesis RNA terhenti  sintesis protein (enzim) terhenti Pengaturan asam amino dapat mengatur sintesis enzim 6. Pengaturan Muatan Energi (ATP ) + 0.5 (ADP) ME = (AMP) + (ADP) + (ATP) ME : enzim yang mensintesis ATP terhambat (isositrat dehidrogenase, fosfofruktokinase) ME : enzim yang mengkonsumsi ATP terhambat (piruvat karboksilase, aspartokinase)

7. Kontrol Permeabilitas secara selektif akan membawa nutrien penting yang dibutuhkan sel 1. Difusi Pasif dengan gerakan molekuler secara acak dan tidak perlu energi  dengan perbedaan konsentrasi Membran Konsentrasi tinggi Konsentrasi rendah Konsentrasi seimbang

2. Difusi Dipermudah - Tidak perlu energi - Solut terikat secara reversibel oleh protein transpor (permease) sebagai “carrier” S S T T TS TS S S S S S = Solut T = Protein transpor

 Energi bebas sistem meningkat 3. Transpor Aktif Melawan gradien konsentrasi dan perlu energi (mekanisme spesifitas tinggi)  laktosa, galaktosa, heksosa-6-fosfat S T T TS TS S ADP + Pi ATP  Energi bebas sistem meningkat S = Solut T = Protein transpor

4. Solut Dimodifikasi Secara Kimia & Perlu Energi contoh : transportasi gula & turunannya  glukosa, fruktosa, manitol E E - S S - X X S S = substrat 1 E = enzim yang terikat pada membran X = substrat 2

TEKNIK MANIPULASI REGULASI  agar mikroba membuat produk dalam jumlah besar 1. Pengubahan Pengaturan Umpan Balik : a. Pembatasan kemampuan sel mengakumulasi penghambatan dan penekanan produk akhir b. Penggunaan mutan tahan terhadap umpan balik (mutasi genotip) 2. Pengubahan Permeabilitas

(1) Produksi senyawa antara pada Lintasan 1. Pengubahan Pengaturan Umpan Balik : 1.a. Pembatasan Akumulasi Produk Akhir (1) Produksi senyawa antara pada Lintasan sederhana  contoh produksi C Enzim a Enzim b Enzim c Enzim d A B C D E Keterangan: : penghambatan enzim a oleh E : penekanan enzim a dan b oleh E : mutan tidak mempunyai enzim c dan membutuhkan E untuk pertumbuhannya (mutan auksotropik = mutan yang mempunyai jalur biosintetik ‘cacat’ tetapi dapat kembali tumbuh normal bila diberi produk lintasan tersebut) Bila diberikan E dalam jumlah sedikit, tidak terjadi penghambatan dan penekanan enzim, sehingga C diproduksi secara berlebihan (dalam jumlah besar)

Contoh: - Bacillus subtilis (auksotropik arginin)  produksi sitrulin (detoxification, energy promotion, immune system stimulation, and arginine production. Lintasan metrabolisme : glutamat    ornithin  sitrulin   arginin - Corynebacterium glutamin (auksotrop arginin)  produksi ornitin (merangsang pankreas menghasilkan insulin, meningkatkan fungsi lever, mengurangi lemak ) Kilogram

PRPP amidotransferase (2). Produksi senyawa antara pada jalur bercabang Contoh : produksi IMP (inosine 5-monophosphate)  peningkat cita rasa oleh Micrococcus glutamicus PRPP Represi Represi Penghambatan PRPP amidotransferase Penghambatan IMP IMP Dehidrogenase XMP GMP S-AMP Sintetase AMP Penghambatan Eksogenus adenin

Keterangan: PRPP : Fosforibosil pirofosfat IMP : inosin 5’-monofosfat AMP : adenosin 5’-monofosfat GMP : guanosin 5’-monofosfat AMP dan GMP merupakan penghambat umpan balik kumulatif : menghambat : menekan : Mutan tidak mempunyai S-AMP sintetase dan membutuhkan eksogenus adenin (prekursor AMP yang permeabel) dalam membuat AMP untuk pertumbuhannya Jadi bila adenin ditambahkan pada batas konsentrasi untuk pertumbuhannya  terjadi ‘over production’ IMP

METHODS OF 5’-NUCLEOTIDE (IMP & GMP) PRODUCTION (1) Direct fermentation of sugars into 5’-GMP and 5’-IMP (2) Direct fermentation of sugars into nucleosides with subsequent phosphorylation into corresponding nucleotides. (3) Degradation of RNA using phosphodiesterase enzyme. Subsequent conversion of 5’-AMP to 5’- IMP using adenylic deaminase enzyme. (4) Any combination of above three procedures xa.yimg.com/kq/groups/21784460/638883800/name/Aula1.ppt

(2). Akumulasi Produk Akhir Pelaksanaan lebih mudah bila jalur reaksi bercabang Prinsip : Bila jalur B ditekan  produksi A melimpah Contoh : fermentasi lisin (aditif serealia) A X B

PRODUKSI ASAM AMINO LISIN Aspartat aspartokinase Aspartil fosfatase Aspartat semi aldehid homoserin dehidrogenase Homoserin Threonin Metionin Isoleusin mutan tidak mempunyai homoserin dehidrogenase & memerlukan threonin untuk pertumbuhan = Dihidropikolinat sintetase Lisin Penghambatan Umpan Balik Harmonis

Lisin & Threonin = penghambatan umpan balik harmonis Threonin ditambahkan pada batas konsentrasi untuk pertumbuhan, sehingga tidak terjadi penghambatan umpan balik harmonis  lisin diproduksi secara berlebihan. Contoh mikroba : - Corynebacterium glutamin - Brevibacterium flavum

(1b). Penggunaan Mutan Resisten Umpan Balik Isolasi mutan dengan cara melihat ketahanan terhadap senyawa beracun yang analog dengan senyawa yang diinginkan (=antimetabolit) mati Sel m.o + antimetabolit ‘survive’ Mampu menghasilkan metabolit dalam jumlah besar

Produksi Asam Amino A Bila sel m.o + asam amino analog (A’) = antimetabolit  mutan yang masih bertahan hidup , resisten terhadap A’ dan masih dapat tumbuh dengan baik dan mampu membentuk A Mutan yang resisten disebabkan : - ada perubahan struktur enzim (mutan tahan terhadap penghambatan umpan balik) - ada perubahan sistem pembentukan enzim (mutan yang tahan terhadap represi umpan balik)

Produk M.O. Resisten analog Substrat L Arginin C. glutamicum D-Arginin, Arginin hidroksamat Glukosa L Histidin C.glutamicum Triazolealanin L Isoleusin B flavum α amino-β hidroksivalerat O metilthreonin L Threonin B. flavum α-amino-β hidroksivalerat

(2) Pengubahan Permeabilitas Produksi Glutamat: - Embden-Meyerhof Parnas (Glikolisis)  Siklus Krebs Bila akumulasi produk glutamat secara intraseluler terjadi sampai jenuh, maka produksi glutamat berhenti oleh sistem penghambatan umpan balik Bakteri : Genus Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium Ciri utama mikroba penghasil glutamat : - Tidak memiliki enzim α-ketoglutarat dehidrogenase, sehingga α-keto glutarat diubah menjadi glutamat & tidak menjadi suksinil Ko-A - memerlukan biotin (‘growth factor’) dalam sintesis asam lemak dalam pertumbuhannya

Modifikasi : Permeabilitas membran harus ditingkatkan  diubah dengan pengaturan penambahan biotin (optimum 1-5μg/l) atau penisilin dan turunan asam lemak Biotin yaitu kofaktor esensial pada biosintesa asam lemak  Defisiensi biotin menyebabkan kerusakan membran sebagai akibat kekurangan fosfolipida. Bila permeabilitas membran meningkat, glutamat akan diekskresikan keluar sel, sehingga produksi glutamat dapat terus berjalan

MSG FAO dan WHO mengelompokkan MSG sebagai Food Additive (zat tambahan makanan) dengan Acceptable Daily Intake (ADI) sebesar 120 mg/kg berat badan/hari. Nilai ambang keamanan ini harus diperhatikan oleh setiap konsumen MSG agar tidak melebihi jumlah konsumsinya. Jika dibuat berat tubuh orang dewasa Indoesia rata-rata sebesar 50 kg maka konsumsi tiap harinya aman jika tidak melebihi 120 mg x 50 = 600 mg (6 g)

http://idblognetwork.com/ process-of-making-monosodium-glutamate.html

Separation Glutamate Acid (GA) The fermentation last 35-45 hours and then the fermentation is centrifuged to remove biomass and the other solid organic materials.  Glutamate acid is in solution with the separated parent resin, where the acid glutamate will be detained in the resin. To get MSG, resin which already contain glutamate acids is regenerate with NaOH solution, where the solvent has been used to regenerate resin, already contain MSG.  Then to get MSG becomes white, this decolorized with active carbon solution. The establishment of the MSG can be seen from the chemical reaction following : Separation Glutamate Acid (GA) The fermentation last 35-45 hours and then the fermentation is centrifuged to remove biomass and the other solid organic materials.  Glutamic acid is in solution then will be separated by resin, where the glutamic acid will be detained in the resin. To get MSG, resin which already contain glutamate acids is regenerate with NaOH solution, where the solvent has been used to regenerate resin, already contain MSG.  Then to get MSG becomes white, this decolorized with active carbon solution. The establishment of the MSG can be seen from the chemical reaction following :

Tugas kelompok  dikumpulkan pada saat UAS Tiap kelompok terdiri dari : 4 orang Buatlah makalah tentang : Pengembangan produk pewarna (pigmen), bahan flavor atau fragrance, enzim atau produk mikrobial lain yang berprospek untuk dikembangkan di Indonesia (pilih satu jenis produk) Outline makalah : - Prospek produk (ketersediaan bahan baku, nilai tambah tinggi, proses feasible dilakukan, substitusi impor dll) - Proses produksi : bahan, proses/mekanisme/ reaksi yang terjadi - Sumber pustaka