KINETIKA ENZIM

Dasar Teori Penting untuk : Memahami fungsi katalitik Memahami fenomena biologik, pengaruh suhu, pH dll. Prosedur pemurnian enzim

Subtrat berinteraksi dengan enzim Perubahan konformasi Sisi aktif beberapa enzim mengandung gugus fungsional residu asam amino (berpartisipasi dalam proses katalitik sebagai pemberi atau penerima proton) Gugus -SH dimiliki oleh sistein Gugus imidazole oleh histidin Subtrat berinteraksi dengan enzim Mol substrat relaksasi + Konformasi perubahan Sisi aktif Dorongan penempatan pa enzim Mol-enzim relaks Mol-enzim dalam keadaan aktif

Faktor2 yang mempengaruhi aktivitas enzim 1) Pengaruh Suhu

Pepsin pH optimum 1,6 2) Glukosa 6 fosfatase pH optimum 7,8 2) Pengaruh pH Pepsin pH optimum 1,6 2) Glukosa 6 fosfatase pH optimum 7,8

3) Pengaruh jumlah substrat

Pengukuran aktivitas enzim: Berdasar pada aktivitasnya. 1 IU, micromol P/menit Pada enzim tertentu : 1 IU, perobahan kepekatan pada 340nm sebesar 0,001 per menit Kecepatan reaksi : jumlah substrat yg diubah per satuan waktu jumlah produk yg terbentuk per satuan waktu

Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim tripsin Prosedur : 1. Panaskan larutan 1% kasein dalam bufer fosfat pH 8.0 sebanyak 30,0 ml, selama 5 menit, pada 380C. 2. Tambahkan bufer fosfat dan larutan enzim dalam bufer fosfat pH 8,0 sesuai daftar dan diaduk rata dan di inkubasikan (setelah penambahan enzim selama 20 menit. 3. Siapkan seperti pd tabel : No. Tabung Substrat Buffer Enzim 1 t = 0 + t=20 menit 2,0 ml 3,0 ml 2 3 4,0 ml 1,0 ml 4 5,0 ml 0,0 ml

4. Inkubasi pada suhu 380C selama 20 ‘ (T 20’) Tambah TCA 3 ml Campuran disentrifugasi 10’ (2000 rpm) Supernatan + 1 mL Follin Ciocalteu + 4 ml 0,5 NaOH. Diamkan 10‘ Bacaabsorbansinya pada 650 nm. T 0 : Penambahan TCA dan kasein dibalik : TCA ditambahkan sebelum inkubasi & kasein ditambahkan setelah inkubasi Y B x A Tugas : Tentukan aktivitas enzim dengan rumus : Absorbansi T20 – Absorbansi T 0 Aktivitas Enzim (v) = --------------------------------------------------- Waktu inkubasi

Data untuk membuat persamaan LR 2) Buat LR, hitung Km & Vmaks y B X A Data untuk membuat persamaan LR Sumbu x Sumbu y Kadar kasein (mL) Kadar (%) Aktivitas Enzim (V0) 2 3 4 5 Kadar kasein mL : dikonversi ke % dengan rumus V1. N1 = V2. N2

Persamaan Michaelis-Menten & Grafiknya Kebalikannya : Grafik mula-mula : [S] vs V0

Pengaruh Lama Waktu Inkubasi terhadap aktivitas enzim tripsin Dasar Metode : Asam amino bersifat zwiter ion, titrasi ditambahkan formalin untuk mengikat –NH2 (dihasilkan senyawa dimetiol) sehingga asam amino berkelakuan penuh sebagai asam dan dapat dititrasi secara alkalimetri.

Prosedur : Campuran t=0 t =15 t=30 t=45 t=60 Gelatin 5% 5 ml Tripsin 1% 2 ml Inkubsi 380C 0 menit 15 menit 30 menit 45 menit 60 menit Tuang masing-2 kedalam erlenmayer + formol 15 ml aduk rata tambah 3 tt ind. pp. Titrasi dengan NaOH 0,02 N ad warna tepat pink Hitung kadar protein

Hitung % nitrogen asam amino dengan rumus : Buat kurva hubungan lama waktu inkubas vs % nitrogen asam amino (Vt – Vo) NaOH x 2, 8 % Nitrogen AA = ------------------------------- x 100% = .... mg/100 ml lar. gelatin ml gelatin

Pengaruh Suhu Inkubasi terhadap Aktivitas Enzim amilase Pengaruh temperatur : Makin tinggi temperatur Makin mudah rusak Enzim lebih stabil pada Temperatur yang rendah

Prosedur Campuran Vol ml Blangko (1) Suhu 0C selama 20 menit 35 40 45 50 60 Amilum 1% 2,0 ml Aqua 1.0ml Amilase 1,0 ml 1,0ml Dapar Tabung masukkan dalam air mendidih 10 menit dinginkan dan tambah 1 ml pereaksi lar. CuSO4 alkalis dan arsenomolibdat @ 1 ml diaduk rata, tunggu 10 menit Encerkan sampai tepat dalam labu takar 10.0 ml Baca absorbansinya pd λ 580 nm.

1) Tentukan aktivitas enzim dengan rumus : Tugas : 1) Tentukan aktivitas enzim dengan rumus : 2) Buat kurva hubungan suhu inkubasi vs aktivitas enzim Absorbansi sampel – Absorbansi blanko Aktivitas Enzim (v) = --------------------------------------------------- Waktu inkubasi