IMUNOASAI (PEMERIKSAAN SEROLOGI) Departemen Patologi Klinik Univ. Wijaya Kusuma Surabaya dr. Febtarini R, Sp.PK

Serologi Suatu ilmu yang mempelajari cara mendeteksi suatu infeksi di dalam serum pasien, misalnya adanya antibodi (Ab) spesifik terhadap mikroba tertentu Uji serologi didasarkan atas ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan antibodi (Ab) Ag yang telah diketahui akan bereaksi/berikatan dengan Ab yang belum diketahui di dalam serum Sebaliknya Ab yang telah diketahui dapat digunakan untuk mendeteksi Ag dalam serum pasien Reaksi Ag-Ab dapat diamati atas terbentuknya presipitasi, aglutinasi atau dengan bantuan label tertentu, misalnya label radioaktif, label enzims dll

2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu ANTIBODI -S-S- Regio variabel L H Fc Fab Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi L = Light Chain H = Heavy chain

Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai a. Spesifitas dari Ab Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya tergantung dari : - profil spesifitas Ab-nya & - kemurnian Ag-nya Ab yang amat spesifik = Ab dengan binding sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan struktur molekul yang unik/tertentu saja.

x y z X Y Z x y z X Y Z X Y Z V W X v w x v w x Antigen I Antibodi I x y z X Y Z x y z X Y Z X Y Z Antigen II Antibodi II V W X v w x v w x Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi yang mungkin terbentuk

b. Ukuran kuantitas Ab Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam serum. - Kualitatif pos. /neg.  adanya perubahan fisik dari bahan pemeriksaan. (+/-) - Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran serum secara progresif  Titer (1/10, 1/100, 1/640) - Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan beberapa sera baku  kurva baku. Akurasi dicek dengan serum kontrol. (100 pg/mL, 2 μL/mL) Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.

OD X 5 g/dl Kadar Bahan Gambar 3. Kurva baku uji ELISA

Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin dll 1 2 Elektrolit dan pH 3 Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuai Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll) 4 Mekanisme Daya Tahan Nonspesifik Bahan yg normal/abnormal terdapat dalam sekret/cairan tubuh. Rasio Ag dan Ab 5

prozone postzone

Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan implikasinya Post zone, Tak ada presipitasi Prozone, Tak ada presipitasi Equivalent zone, Presipitasi Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan implikasinya = ANTIBODI = ANTIGEN

BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI MACAM BAHAN : serum , plasma, css Usahakan jangan hemolisis Inaktivasi C  56°C, 30 menit Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat sendiri dari strain lokal, lebih baik yang multistrains.

Hasil reaksi DAPAT DILIHAT FAKTOR PENGUAT (LABEL) IMUNOASAI KADAR BAHAN RENDAH ( ng/ml, pg/ml ) TINGGI (mg/ml,ug/ml) Hasil reaksi tak tampak Hasil reaksi DAPAT DILIHAT  Presipitasi/RID FAKTOR PENGUAT (LABEL)  UJI AGLUTINASI IF RIA EIA ICA Homogen Heterogen = ELISA

JENIS IMUNOASAI Ada 2 jenis imunoasai. I. IMUNOASAI TAK BERLABEL II. IMUNOASAI BERLABEL I. IMUNOASAI TAK BERLABEL  UJI PRESIPTASI  UJI AGLUTINASI  UJI FIKSASI KOMPLEMEN  UJI NETRALISASI TOKSIN

UJI PRESIPITASI Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi Ag yang larut Antibodi Presipitasi adalah bila Ag + Ab dalam bentuk larutan menghasilkan suatu agregasi yang terlihat dengan mata PRESIPITASI Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi

Gambar 6. Uji presipitasi tabung Ag. Serum dengan Ab Inkubasi Presipitasi Gambar 6. Uji presipitasi tabung

Sera baku 1 2 8 Antisera dalam agar 3 7 4 6 5 GAMBAR 10. R.I.D Tes serum 2 8 Antisera dalam agar 3 7 Tes serum 4 6 Tes serum Tes serum 5 Tes serum GAMBAR 10. R.I.D

APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI Uji Tabung : VDRL - Makro Uji Slide : VDRL - Mikro Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP RID : Penentuan kelas Ig

Imunoelektroforesis Migrasi protein serum di dalam gel dan apabila bertemu dengan antigen yang sesuai akan terjadi presipitasi

UJI AGLUTINASI Tak larut Aglutinasi Ab. Ag. pada permukaan sel Aglutinasi Ab. Tak larut Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi

+ - Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide

Susp. Ag Inkubasi Aglutinasi Serum ( Ab ) Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung

AGLUTINASI TAK LANGSUNG A. AGLUTINASI PASIF B. Ab TAK LENGKAP a. Ab Monovalen b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )

+ + Gambar 14. Uji aglutinasi pasif Partikel Ab dalam serum Ag Larut Partikel disalut Ag Partikel: Seldarah merah Lateks Carbo adsorben (Ko-aglutinasi) Aglutinasi Gambar 14. Uji aglutinasi pasif

APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI Uji Slide (lempeng): uji Widal slide  Uji Tabung : uji Widal tabung  Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung, Hanya Anti – Ig diganti C  Lisis Imun

UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN Komplemen di dalam plasma sebanyak 3 mg/ml dalam bentuk inaktif Jika bertemu dengan kompleks Ag-Ab komplemen menjadi aktif (melalui jalur klasik), dan menghasilkan berbagai kaskade aktivasi, misalnya lisis dari sel target

Prinsip Uji Komplemen

Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun Komplemen Sensitized cell Ab Ag pada permukaan sel = Komplemen Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun

C Lisis Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen A. Tak ada Lisis Uji Positif Terikat Sensitized SDM B. Lisis Bebas Serum dgn. Ab Serum tanpa Ab Uji Positif Uji Negatif Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen

An example of the complement fixation test. Fig. 17.14 Complement fixation test.

II. IMUNOASAI BERLABEL 1. CAT FLUORESENS: 2. RADIOISOTOP: 3. ENZIM: IF 2. RADIOISOTOP: RIA 3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA ) A. EIA HOMOGEN B. EIA HETEROGEN (ELISA) C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE 4. EMAS KOLOIDAL: ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)

Ab diket berlabel cat fluoresens 1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF) CUCI Mikroskop Fluoresens Ab diket berlabel cat fluoresens Ag tak diket. Fiksasi pada slide Kompleks Ag-Ab Berfluoresensi Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens langsung (direct).

AHG dilabel Fluorescein Cuci AHG dilabel Fluorescein Ab tak diket Kompleks Ag – Ab tak tampak Ag diket. Cuci Mikroskop Fluoresens Kompleks Ag – Ab – AHG berfluoresensi Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens tak langsung (indirect).

An example of direct and indirect immunofluorescence testing. Fig. 17.15 Immunofluorescence testing

KELEMAHAN UJI IF  Peralatan canggih dan mahal  Perlu tenaga terlatih  Per hari maks 25 slide / analis  Sukar dibuat otomatis  Pelaksanaan agak kompleks & membosankan

R R R R R R R R R 2. Uji RIA Radiation Counter Radioisotop : 3H Thymidin, 131 I Radiation Counter Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA R = label radioisotop

Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif Cuci RADIATION COUNTER Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif

KELEMAHAN UJI RIA  Butuh alat mahal & tenaga terlatih  Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )  Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.  Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Prinsip dasar Elisa adalah pemakaian enzim untuk mendeteksi adanya ikatan Antigen-Antibodi (Ag:Ab) Enzim akan merubah (mengkonversi) substrate yang tidak berwarna (kromogen) menjadi produk berwarna yang mengindikasikan adanya ikatan Ag:Ab

Anti –Ig berlabel enzim SUBSTRAT berkromogen Ag pada Fase padat PRODUK berwarna Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA langsung

Direct ELISA Untuk mendeteksi Ab Enzim: AK (Alkalin fosfatase) atau HRPO (Horse Raddish Peroxidase) Substrate : TMB (Tetra methyl benzidine) atau NPP (p-nitrophenyl phosphate)

Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung) double antibody sandwich ELISA Ab II berlabel enzim Ag SUBSTRAT berkromogen Ab I pada Fase padat PRODUK berwarna Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung) double antibody sandwich ELISA

Indirect ELISA (Sandwich ELISA) Untuk mendeteksi adanya antigen (Ag)

ELISA Antibodi dilapiskan pada dasar sumuran Bahan yg diperiksa ditambahkan → terjadi reaksi Ag-Ab Ditambahkan anti-antibodi ( Mo anti-Ab) berlabel BIOTIN (biotinylated) Ditambahkan streptavidin berlabel enzim Ditambah kromogen → Warna, diukur secara kolorimetri memakai Elisa-reader

Uji ELISA Ab pada Fase padat PRODUK berwarna Ag dlm serum SUBSTRAT BERKROMOGEN Ag berlabel enzim Ab pada Fase padat PRODUK berwarna Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif

An example of the indirect and capture ELISA methods. Fig. 17.16 Methods of ELISA testing.

CONTOH APLIKASI KLINIS SEROLOGI TEST Sifilis Demam tifoid Tuberkulosis

Paling Ideal ; Ig. M- ELISA ( Dx, keaktivan, mengikuti hasil Rx ) SIFILIS Paling Ideal ; Ig. M- ELISA ( Dx, keaktivan, mengikuti hasil Rx ) Di Indonesia ; TPHA  Dx VDRL  Aktivitas & mengikuti hasil Rx Neurosyphilis : VDRL  Dx Jumlah sel Protein Total Keaktivan & mengikuti hasil Rx

UJI SEROLOGI DEMAM TIFOID TES WIDAL TES IgM Salmonella ELISA BIAKAN / KULTUR DARAH

UJI WIDAL (AGLUTINASI) Dari hasil 1X tes belum dapat ditarik kesimpulan yang berarti. Perlu ulangan setelah 5-7 hari Harga normal tes Widal tabung. Aglutinin O : 1/160 Aglutinin PA : 1/80 Aglutinin H : 1/160 Aglutinin PB : 1/320 Vaksinasi; aglutinin H dapat dipertahankan beberapa tahun, Antibiotika ; dapat memperlambat kenaikan titer

INDIKASI SEROLOGI TB INDIKASI: BTA DAHAK NEGATIF TB EKSTRAPULMONUM TB ANAK SPESIFISITAS: TGT JENIS ANTIGEN (REAKSI SILANG) KONTROVERSI KARENA: Kurang pemahaman patogenesis Bersikukuh pada Postulat Koch

Lateral flow immuno assay

CONTOH PARAMETER PEMERIKSAAN SEROLOGI CRP = Protein C reaktif - Suatu alfa globulin yg ada di serum pd inflamasi Suatu reaktan fase akut, indikator non spesifik inflamasi yg berhbgn dg imunologi Tidak dipengaruhi oleh anemia, kehamilan, hiperglobulinemia serial, utk indeks aktivitas penyakit dan monitoring terapi

FAKTOR REMATOID Antibodi Rheumatoid factor Poliklonal antibodi Antibodi IgG dalam kelas IgM Kadar IgM terbesar, bisa dideteksi oleh alat Antibodi terhadap determinan antigenik pada fragmen Fc immunoglobulin Sumber: PKB PK,2002

TERIMA KASIH ATAS PERHATIAN ANDA