KROMATOGRAFI KOLOM SEDERHANA Any Guntarti

Kromatografi Kolom Sederhana Bergerak / aliran karena gaya grafitasi ↓ Pemilihan fase diam + fase gerak Kepolaran Pita-pita kromatogram Terbentuk fraksi-fraksi Dianalisis dengan KLT / KK↓

Pemisahan Secara Kromatografi Mikhail Tswett ↓ Pigmen tumbuhan Pita-pita

Pengisian Kolom fase diam homogen fase diam ukuran sama fase diam bentuk seragam bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

Kolom kromatografi sederhana (learning kolom)

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4 Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4 Isolat yang diambil Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm. Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4 A: isolat hasil isolasi I B: isolat hasil isolasi II A B Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm. fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Hasil spektra Spektrofotometri UV

Hasil spektra Infra Red

Gambar. berbagai metode pemisahan Contoh: Termometer a b c d 3 2 1 d 2 3 1 4

Klasifikasi Sistem Kromatografi Umum Tehnik Spesifik Fase diam Keseimbangan 1. K. Cair (LC) LLC LSC IEC Cair pd padatan Padatan Resin Partisi Adsorbsi Tukar ion 2. K. Gas (GC) GLC GSC Gas terikat P / A

SKALA PRIORITAS / DERET ELUOTROPIK Pelarut Kekuatan / E0 n.Pentana Iso oktana Siklo hexana CCl4 Xylena Toulena Benzena CHCl3 Aseton Etil asetat Anilin Asetonitril Iso propanol Etanol Metanol Asam asetat 0.01 0.04 0.18 0.26 0.29 0.32 0.40 0.56 0.58 0.62 0.65 0.82 0.88 0.95 besar

Kromatografi Fase diam fase gerak ↓ ↓ Statinary phase mobile phase Pemisahan ↓ Perbedaan laju migrasi Polaritas senyawa

Hukum Distribusi Kromatografi ↓ perbedaan distribusi komponen di dalam FG & FD ↓ koefisien distribusi / partisi (K) ↓ K = CS /CM CS : kons. Molar komponen dlm FD CM: kons. Molar komponen dlm FG

Secara ideal : CS & CM ↓ kurva linier Macam-macam bentuk kesetimbangan CS & CM D CS B A C CM CM Kurva A : ideal → tidak saling campur → kromatografi Linier B/C : ada asosiasi & desosiasi D : ada reaksi isoterm adsorpsi ↓ Kromatografi → cenderung kurva A → konsentrasi relatif rendah

Elusi dalam kolom kromatografi Elusi : proses terbawanya komponen dlm suatu camp, shg ada pemisahan komponen yg dibawa oleh FG dari ujung atas kolom → bawah tR : waktu yg diperlukan oleh komponen untuk bermigrasi sepanjang kolom Vr : volume FG yg dibutuhkan untuk membawa komponen dari titik awal kolom → akhir kolom Solvent Sp E B + E kolom E A + E E D signal tR

F : laju alir FG yang menyatakan jumlah vol FG per satuan waktu ↓ F = VR / tR tR = VR / F Dalam kolom yang ideal Komp. yang tidak teretensi t = 0 Komp. di atas memerlukan waktu untuk bermigrasi → tM : waktu FG melewati kolom VM : fraksi volum kolom yang dilalui komponen → tR’ = tR – tM VR’ = VR – VM terkoreksi

Teori Lempeng (Plate Theory) ↓ Martin & Synge (1941) Efisiensi kolom Untuk menerangkan proses pemisahan dlm kromatografi ada 2 macam teori : Teori Lempeng (Plate Theory) ↓ Martin & Synge (1941) Efisiensi kolom Apabila jumlah kesetimbangan makin besar → efisiensi >> → menambah jumlah lempeng (N) → tebal lempeng teoritik → H N & H → menyatakan efisiensi Secara matematis : N = L / H Kelemahan teori : tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yang mempengaruhi pelebaran pita kromatogram

Dapat mengatasi kelemahan teori Plate. → teori laju / rate theory ↓ 2. Teori Kinetik ( Kinetics Theory) Dapat mengatasi kelemahan teori Plate. → teori laju / rate theory ↓ Partikel komponen bermigrasi diantara FG & FD Migrasi sangat tidak teratur Energi thermal Gerakan partikelnya random Ditribusi simetrik Gauss

H.E.T.P H = 16 L x (Wb / tR)2 N = 16 x (tR / Wb)2 = (4tR/W)2 Simetrik Gauss → t (waktu) lama →puncak lebar

H = A + B /µ + C.µ Menurut Van Deemter ↓ Ada 3 proses secara stimultan yg mempengaruhi variabilitas laju migrasi komponen diantara FG & FD : Difusi Eddy (Eddy diffusion) Difusi longitudinal (longitudinal diffusion) Proses transfer massa Pada tebal lempeng teoritik (H) → merupakan fungsi linier variabilitas laju migrasi komponen Persamaan Van Deemter H = A + B /µ + C.µ A = koefisien Difusi Eddy B = koefisien Difusi longitudinal C = (CS + CM) = koefisien total

Pada tebal lempeng teoritik Difussi longitudinal ↓ Pelebaran pita Molekul komponen dlm FG → bermigrasi dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah Kontribusi variabilitas laju migrasi yg menurun secara hiperbolik terhadap kenaikan kecepatan linier FG (µ) Pada tebal lempeng teoritik DM = koefisien difusi komponen FG Ψ = kualitas packing FD 0,6 2ΨDM B HLD = = µ µ

Pelebaran pita Transfer Massa ↓ Konstribusi H akan naik apabila kec. Linier FG naik Makin cepat kec. FG akan makin singkat proses transfer massa → pemisahan rendah Pelebaran pita diffuse Eddy Akibat tidak homogen pori dalam packing kolom Ada yang jalannya pendek dan ada yang panjang

H = A + B / µ + C.µ → Persamaan Van Deemter Composite curve C standar H. Opt C mobile H H min A Proses migrasi H = A + B / µ + C.µ → Persamaan Van Deemter

Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalami retensi & tidak tA Sinyal analitik tM t (waktu) W Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalami retensi & tidak konsentrasi A B Jarak migrasi Profil konsentrasi komp. A & B dalam kolom pada jarak migrasi yang berbeda

VARIABEL TERMODINAMIKA PADA PEMISAHAN Mempengaruhi kualitas kolom Waktu Retensi 2. Faktor-faktor kapasitas kolom (k’) Ratio jumlah molekul komponen dalam FD terhadap jumlah molekul komponen dalam FG V = tR tM x µ Laju migrasi komponen

k’ = nS nM [ CS x VS ] [ CM x VM ] = k’ = VS VM x k k’ = ( tR – tM) tM Lanjutan… k’ = nS nM [ CS x VS ] [ CM x VM ] = Pengalaman : k’ < 1 ↓ Tidak memisah Disarankan : k’ semakin besar Pemisahan ↑ k’ > 10 Tidak ekonomis k’ = VS VM x k k’ = ( tR – tM) tM tR’ =

3. Faktor selektivitas (α) ↓ Ratio koef. Distribusi 2 komponen yang akan dipisahkan Menggambarkan kemampuan pemisahan suatu kolom α = KB / KA KB / KA = koef. Distribusi komp. B / A Dimana : KB = koef. Distribusi komponen B yg teretensi kuat dalam kolom KA = koef. Distribusi komponen A yg teretensi lemah dalam kolom

Ada hubungan dengan k’ ↓ α = KB’ / KA’ (tR)B - tM (tR)A - tM

Hubungan dengan faktor-faktor lain 4. Resolusi Kolom (Rs) ΔZ = jarak puncak A & puncak B WA = lebar dasar kromatogram A WB = lebar dasar kromatogram B RS= ΔZ 0,5WA + 0,5WB 2 ΔZ ( WA + WB ) = WA + WB 2 [ (tR)B – (tR)A ] RS= Disarankan RS ≥ 1,5 ↓ Hubungan dengan faktor-faktor lain RS = VN 4 x ( α – 1) α k’B ( 1 + k’B )

Semoga Bermanfaat ...

Sesungguhnya sedekah itu dapat menghilangkan murka Alloh & dapat menghilangkan kematian yang buruk (HR. at-Tirmidzi)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Any Guntarti

SKEMA HPLC Injektor Kolom analitik C18 D Ke penampungan POMPA Integrator

Instrumen HPLC

Reservoir Fase Gerak ↓ Bisa lebih dari 1 dari gelas / stainless steel Daya tampung 1- 2 L Dilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di dalam kolom & detektor - Pelebaran pita analit - Respon detektor terganggu

Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir & diaduk / dipanaskan Solven disaring dengan kertas Millipore Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan → Elusi Isokratik Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda → Elusi Gradien Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang reprodusibilitas optimum dalam pemisahan

2. Pompa Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi) Kec. Alir 1-3ml/menit Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless steel Tidak ada pulsa getaran Kontinyu

3. Peredam Pulsa Fase Gerak Ada beberapa detektor sensitive terhadap variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi, elektrokimia & konduktometer Peredam aliran dengan gas yang ditekan

4. Sistem Injeksi Sampel Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas sampel Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi → merupakan pita dengan sampel tipis → pelebaran diperkecil Konvensional atau automatik

Injektor Automatik

5. Kolom Kromatografi Bentuk tabung, permukaan dalam rata Dari gelas / stainless steel Lapisan luar kadang dilapisi logam → menahan tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FG Sambungan kolom → tidak menyebabkan FG stagnant Panjang kolom (10 – 30) cm Analisis pemisahan cepat (3 – 8) cm Internal diameter (4 – 5)mm Partikel diameter (3 – 5) µm Guard kolom → sebelum kolom analitik

Kolom dari stainless steel

Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan ↓ 6. Detektor Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan ↓ Harus sensitif (menghindari pelebaran) Ada 2 macam : Berdasarkan sifat umum larutan Refraktif indeks → control temperatur Kurang sensitive

2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel UV – Vis Fluorescence Elektrokimia ↓ Sinyal analit yang berbeda dari FG Lebih sensitif (µg – ng) Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom

Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC tempat injeksi kolom Detektor 0.506 1.50 kapiler bentuk koil Pompa sampel Pompa pereaksi penampung Fase gerak pereaksi

Alur sampel ke Detektor

7.Interpretasi output dari Detektor/integrator Direkam berupa rangkaian puncak-puncak Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif

Profil kromatogram Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin disebabkan : Karena Y lebih sedikit dari X Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

Fase Normal HPLC Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase Balik/Reverse Phase HPLC Silika dimodifikasi menjadi non polar berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.

Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC