SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062 APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS PADA KEPITING SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062 Dibawah bimbingan: Ir. Ibnu Dwi Buwono, Msi Ir. Evi Liviawaty, MP UNIVERSITAS PADJADJARAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN PROGRAM STUDI PERIKANAN JATINANGOR

Serangan virus white spot LATAR BELAKANG... Produksi Udang Windu Serangan virus white spot Organisme Carrier Metoda Deteksi Virus PCR Konvensional Real Time PCR

PCR Konvensional PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara in vitro. Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis.

Real Time PCR Real Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut (Fatimi 2010). Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk menghitung jumlah kopi DNA atau threshold cycle (Ct) dari patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).

IDENTIFIKASI MASALAH Berdasarkan uraian diatas maka dapat diidentifikasi masalah yaitu sejauh mana potensi dan tingkat serangan kepiting sebagai carrier dalam penginfeksian penyakit White Spot Syndrome Virus pada udang windu dengan menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR TUJUAN PENELITIAN Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi White Spot Syndrome Virus yang terbaik pada kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi udang windu dengan menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR. KEGUNAAN PENELITIAN Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada petambak udang windu tentang potensi kepiting yang merupakan carrier WSSV yang menyerang udang windu sehingga petambak dapat mengantisipasi secara dini penyakit WSSV.

Pendekatan Masalah... Budidaya Udang Windu Mengalami penurunan produksi Penurunan mutu lingkungan Serangan penyakit Hama PCR Konvensional Deteksi Organisme carrier Kepiting Real Time PCR Hasil Penelitian

Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR. Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji Nested PCR. Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per rekasi. Pada pengujian 1 sampai 108 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 104 kopi/µg DNA.

Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Mei sampai Juli 2012. TEMPAT Pengambilan sampel dilakukan di tambak udang windu di Kecamatan Indramayu dan Pasekan Kabupaten Indramayu. Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Pemeriksaan dengan PCR konvensional dan pemeriksaan dengan real time PCR dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta WAKTU Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Mei sampai Juli 2012.

Alat-Alat Penelitian Botol plastik, cool box Pengambilan Sampel Autoclave, Analytical balance, gunting, pinset, sumpit plastik, mikrotube 1,5 ml, rak mikrotube, centrifuge, refrigerator, waterbath, vortex, mikropipet, mikrotips, timer,, sarung tangan, spidol marker Isolasi PCR Chamber, GeneAmp PCR System 9700, Mesin Rotor-Gene Q yang dihubungkan dengan perangkat komputer, vortex, microcentrifuge, deep freezer, mikrotube 0,2 ml dan 0,5 ml, mikropipet, mikrotips, cooler block, beaker glass, sarung tangan Amplifikasi Bejana elektroforesis dilengkapi dengan power supply, tangki, sisir, tutup, Analytical balance, Botol Scott, Gelas ukur ukuran 50 ml, corong, microwave, Ultraviolet illuminator, sendok kecil, mikropipet, mikrotips, waterpass, cooler block, parafilm, sendok pipih, refrigerator, kamera digital, sarung tangan Elektroforesis

BAHAN-BAHAN PENELITIAN Metode PCR Konvensional Metode Real Time PCR Pengambilan Sampel Larutan Preservasi Alkohol : Gliserol (4:1) Es Curai Isolasi Sampel kepiting Nuclei Lysis Solution 0,5M EDTA pH 8,0 Proteinase K RNase Solution Protein Precipitation Solution Isopropanol Ethanol 70% DNA Rehydration Solution Es curai Amplifikasi Promega Go Taq® Green Master Mix Plasmid (+) standar sebagai kontrol positif WSSV Nuclease Free Water (NFW) Primer WSSV 270 dan WSSV 345 DNA template Elektroforesis Agarose TAE (Tris Acetic Acid EDTA) Buffer 50X Sybr Safe Loading Dye DNA Marker Ethidium Bromide (EtBr) Aquadest Steril Amplifikasi dengan Real Time PCR Rnase-free water, 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix Primer WSSV 270 dan Primer WSSV 345 Probe WSSV 296T Standar Positif (+) WSSV 2 x 105

METODE PENELITIAN Metode penelitian yang digunakan adalah metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan analisis data.

PROSEDUR PENELITIAN Isolasi Pengambilan Sampel Analisis Data Kepiting sebanyak 7 ekor dari setiap lokasi tambak Pemeriksaan dengan Real Time PCR Pemeriksaan dengan PCR Konvensional Amplifikasi Setting Profil PCR Preparasi Reagen PCR Elektroforesis Proses Real Time PCR Analisis Data Interpretasi Data

First Step PCR 23µl 23µl 23µl 23µl Kontrol Negatif 8,5µl NFW x (jumlah sampel + 2)* 1µl F1 x (jumlah sampel + 2)* 1µl R1 x (jumlah sampel + 2)* 12,5µl Master Mix x (jumlah sampel + 2)* 23µl 23µl 23µl 23µl Kontrol Negatif 2 µl template DNA sampel 2 µl template DNA sampel 2 µl plasmid + sebagai kontrol positif

ELEKTROFORESIS Pembuatan Gel Agarose Loading Hasil Amplifikasi PCR Running Elektroforesis Dokumentasi Gel dengan UV

Pengenceran Standar Positif Pembuatan Campuran Reaksi Real Time PCR 1µl + 9µl NFW 1µl + 9µl NFW Pengenceran Standar Positif Pembuatan Campuran Reaksi Real Time PCR Stok 105 104 103 9 µl Rnase-free water x (jumlah sampel + 4)* 12.25 µl 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Primer WSSV270 x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Primer WSSV345 x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Probe WSSV296T x (jumlah sampel + 4)* 23µl 23µl 23µl 23µl 23µl 23µl 23µl 2 µl template DNA sampel 2 µl template DNA sampel 2 µl template DNA sampel 2 µl plasmid kontrol + 105 2 µl plasmid kontrol + 104 2 µl plasmid kontrol + 103 2 µl NTC

Analisa Data... Data yang diperoleh dari hasil penelitian akan dianalisis secara deskriptif kualitatif yaitu membandingkan hasil DNA WSSV yang terdeteksi dengan menggunakan metoda PCR Konvensional dan Real Time PCR.

HASIL DAN PEMBAHASAN Pengamatan Gejala Klinis Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional Hasil Deteksi Wssv Dengan Real Time PCR Perbandingan Hasil Deteksi PCR Konvensional Dan Real Time PCR

Pachygrapsus marmoratus PENGAMATAN GEJALA KLINIS Lokasi Organisme Jumlah (ekor) Pasekan Scylla serrata 2 Helice tridens 1 Pachygrapsus marmoratus 4 Karangsong Ocypode quadrata  1 Uca minax  2 Total 14 Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis terserang virus white spot, yaitu adanya bintik putih pada bagian tubuh.

Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom 1 Sampel Panjang Gelombang (nm) Konsentrasi/C (ng/µl) Rasio Absorbansi (R) A260 A280 Pachygrapsus marmoratus (A1) 0,031 0,012 160 2,583 Pachygrapsus marmoratus (A2) 0,039 0,018 185 2,167 Pachygrapsus marmoratus (A3) 0,001 0,009 5 0,111 Pachygrapsus marmoratus (A4) 0,133 0,074 665 1,797 Scylla serrata (B1) 0,021 0,007 105 3,000 Scylla serrata (B2) 0,067 0,035 330 1,914 Helice tridens (C1) 0,016 0,004 75 4,000 Helice tridens (D1) 0,200 1005 1,802 Helice tridens (D2) 0,109 0,050 540 2,180 Helice tridens (D3) 0,354 0,180 1765 1,967 Helice tridens (D4) 0,115 0,053 565 2,170 Uca minax (D5) 0,099 0,046 490 2,152 Ocypode quadrata (D6) 0,059 0,026 290 2,269 Uca minax (D7) 0,064 0,030 320 2,133 SPEKTROFOTOMETER 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ELEKTROFORESIS

Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional : 1 Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Keterangan : M = Marker 100 bp DNA Ladder 9 = Sampel C1 Helice Tridens 1 = Kontrol Positif (76 bp) 10 = Sampel D1 Helice Tridens 2 = Kontrol Negatif 11 = Sampel D2 Helice Tridens 3 = Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 12 = Sampel D3 Helice Tridens 4 = Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 13 = Sampel D4 Helice Tridens 5 = Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 14 = Sampel D5 Uca minax 6 = Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus 15 = Sampel D6 Ocypode quadrata (76 bp) 7 = Sampel B1 Scylla serrata (76 bp) 16 = Sampel D7 Uca minax (76 bp) 8 = Sampel B2 Scylla serrata (76 bp)

Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR Pengenceran Standar Kurva Kurva standar sampel asal tambak Pasekan memiliki nilai slope -4,45724, nilai efisiensi 67,63% dan nilai R2 mencapai 0.99398. Adapun persamaan garis dari kurva standar yaitu y = -4.457x + 39.629 dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang diuji. y = -4.457x + 39.629 Kurva standar sampel sampel asal tambak Karangsong memiliki nilai slope -4.64589, nilai efisiensi 64,15% dan nilai R2 mencapai 0.99941. Persamaan garis dari kurva standar yaitu y = -4.646x + 43.805 dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang diuji.

Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan Keterangan : 6 Sampel positif WSSV 1 Sampel negatif WSSV

Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong Keterangan : 6 Sampel positif WSSV 1 Sampel negatif WSSV

PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR No. Kode Sampel Spesies PCR Konvensional* Real Time PCR Nilai Ct Jumlah Kopi WSSV 1. Kontrol + Std wssv 2 x 105 16.20 180,335.5 2. Std wssv 2 x 104 20.06 24,599.6 3. Std wssv 2 x 103 25.12 1,803.4 4. A1 Pachygrapsus marmoratus Positif 29.84 157.0 5. A2 30.86 92.5 6. A3 31.68 60.8 7. A4 Negatif 30.92 89.9 8. B1 Scylla serrata 30.19 131.2 9. B2 31.67 61.0 10. C1 Helice tridens - 11. D1 37.39 24.1 12. D2 13. D3 37.83 19.3 14. D4 37.78 19.8 15. D5 Uca minax 37.19 26.5 16. D6 Ocypode quadrata 36.67 34.3 17. D7 35.03 77.6 Keterangan : 12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV) 2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV

KESIMPULAN DAN SARAN KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinis dibandingkan dengan PCR konvensional. Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah Pachygrapsus marmoratus, Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax. Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76 bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu. Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu. SARAN Berdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis, serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.

TERIMA KASIH