Molecular characterization of XVSAP1, a stress-responsive gene from the resurrection plant Xerophyta viscosa Baker1 Dahlia Garwe, Jennifer A. Thomson and Sagadevan G. Mundree2 Molecular and Cell Biology Department, University of Cape Town, Private Bag, Rondebosch, 7701, South Africa Eko Amiadji Julianto

LATAR BELAKANG Faktor lingkungan yang merugikan seperti suhu ekstrem dan tekanan osmotik akibat kondisi salinitas tinggi dan kekeringan, mempengaruhi pertumbuhan, produktivitas dan distribusi tanaman. Respon terhadap tekanan abiotik dimediasi melalui modifikasi fisiologis, morfologis dan metabolisme yg terjadi di semua organ tanaman. Ekspresi gen dalam menanggapi lingkungan yang berbeda hasil rangsangan dari transduksi sinyal kaskade kompleks yang dimulai dengan persepsi stimulus diikuti dengan cara pengolahan amplifikasi dan integrasi sinyal. Langkah final adalah reaksi respon dalam bentuk de novo ekspresi gen Meskipun respon umum terhadap stres abiotik mirip di semua tanaman, ada sekelompok tanaman yang dikenal sebagai `Tanaman kebangkitan ‘ (`resurrection plants‘) yang telah mengembangkan mekanisme yang memungkinkan mereka untuk menahan kekurangan air yang parah. Tanaman Kebangkitan bisa kehilangan lebih dari 90% kadar air mereka, bertahan hidup dalam keadaan kering mereka untuk waktu yang lama dan kemudian melanjutkan hidup aktif saat air menjadi tersedia lagi.

Studi tanaman yg toleran pengeringan telah dipelajari dalam beberapa spesies mewakili kelompok yang berbeda: lumut Tortula ruralis, yang monokotil porobolus stapfianus (Blomstedt . et al, 1998; Oliver, 1996; Neale et al, 2000) dan dikotil Craterostigma plantagineum (Bartels et al., 1990). Diperkirakan bahwa dua mekanisme dasar ada yang memungkinkan tanaman toleran pengeringan untuk bertahan hidup dalam kekurangan air : Yang pertama melibatkan perlindungan terhadap integritas/kekompakan sel melalui diinduksi dan terjadi dgn sendirinya Kedua melibatkan perbaikan pengeringan atau rehidrasi disebabkan kerusakan. Sudah ditunjukkan bahwa beberapa gen terekspresi secara berbeda terhadap dehidrasi, sudi secara genetik maupun biokimia menunjukkan bahwa hormon ABA berperan penting pada respon terhadap kekeringan, garam, dan dingin ABA juga memainkan peran penting dalam proses fisiologis seperti sebagai penutupan sel penjaga pada kondisi cekaman kekeringan dan regulasi beberapa peristiwa selama pengembangan benih akhir

Karakterisasi terhadap gen Em dari gandum (gen yg bertanggung jawab terhadap kekeringan dan diinduksi dgn adanya ABA dan rab 16 A dari padi, berdasar pada ekspresi gen nya (pembentukan enzim/protein menunjukkan bahwa ada alamat yg disebut ABRE yg penting pada proses transkripsi (dr DNA – mRNA), element ABRE terdiri dari 8-10 pasang basa yg intinya berupa ACGT Sintesis protein dan sangat hidrofilik dgn tampilan globulan yg dikenal sbg protein LEA diketahui sbg protein yg bertanggung jawab pada respon terhadap cekaman dehidrasi, salinitas dan dingin, protein ini terakumulasi, berperan sbg osmoletey (menjaga tekanan osmotis sel), LEA berperan penting dalam menjaga membran, pengangkutan ion dan air. Suhu rendah mempengaruhi fungsi normal dari intergral protein membran seperti protein transporter dan reseptor yg mempengaruhi kelembaban membran Produk dari gen pengatur dingin seperti COR 6.6 dan COR 78 mungkin melindungi tanamn dari stress dingin Studi pada Arabidopsis mengungkapkan bahwa elemen pengatur DNA berupa C-yg terulang yg disebut DRE, mempunyai core dgn urutan CCGAC yg yg selalu muncul ditanaman lain, aktifator transkripsi yg menempel pada DRE disebut CBF, dan DREBIA, DRE berperan dalam tempertur rendah dan dehidrasi Danklud mengidentifikasi gen mirip, WCOR410, yg homolog dgn WCOR 416, protein yg dihasilkan dari gen tersebut terlibat dalam melindungi membran akibat cekaman dehidrasi WCR 120 yg mengkode protein yg homolog dgn dehidrasi dijumpai diakumulsi sbg respon dingin dimana promotor gen nya dipicu oleh cekaman2 luar

Mundree et al. (2000) mengisolasi gen dari X Mundree et al. (2000) mengisolasi gen dari X. viscosa yang hasilnya covered dgn E. coli (srl :: Tn10). Sdh berhasil di isolasi dari cDNA daun X. viscosa. Protein menunjukkan kemiripan 49% dengan protein toleran dingin WCOR413, dari Triticum aestivum (Danyluk dan Sarhan, 1996). XVSAP1mirip (56%) dengan protein yg belum terkarakter dari Arabidopsis dimana protein dari Arabidopsis mirip 64% dari WCOR413.

Bahan dan metode Tanaman X. Viscosa dikumpulkan dari Cadangan Alam Buffelskloof (Provinsi Mpumalanga, Afrika Selatan). C DNA disisipkan pada plasmid pBlue Dalam pemeliharaan protein yg terbentuk disebut XVSAP1 Ekspresi XVSAP1 yg ditumbuhkan pada cekaman tekanan osmose, XVSAP1 diklon pada pPro dan ditransformasi ke E Coli Tanaman eksperimental disiram untuk memastikan hidrasi penuh sebelum percobaan stres. Air Relatif konten (RWC) determinasi seperti yang dijelaskan oleh Sherwin dan Farrant (1996). Konstruksi dan pemutaran bahan cDNA adalah seperti yang dijelaskan sebelumnya (Mundree et al., 2000). Sebuah insert cDNA di pBluescriptSK + (Stratagen, La Jolla, CA) bernama XVSAP1 digunakan untuk percobaan yang dijelaskan dalam makalah ini. XVSAP1 ekspresi dalam osmotik menekankan Escherichia coli XVSAP1 diklon ke dalam Ekspresi Prokariotik pPROEXHT Vector System (Life Technologies, Inc, USA). E. coli (srl :: Tn10) sel diubah dengan pPROEXHT-XVSAP1 membangun dan tumbuh di M9 minimal medium dengan 1 mM MgSO4.7H2O, gliserol 0,2%, 0,1% vitamin B, dan 100 mg ml ± 1 ampisilin. Kultur sel diinduksi dalam rangkap dengan menambahkan 0,2 mM isopropil thiogalactopyranoside (IPTG) setelah OD600 dari sel telah mencapai sekitar 0,5. Sel-sel dibiarkan tumbuh selama 2 jam sebelum stres osmotik dipaksakan dengan menambahkan 4M sorbitol dengan konsentrasi final dari 1 M. Pertumbuhan sel adalah dipantau dengan mengambil pembacaan absorbansi pada 600 nm selama 48 jam periode. Percobaan diulang tiga kali.

Analisis urutanXVSAP1 (XVSAP1 sequence analysis) Urutan nukleotida dari XVSAP1 ditentukan dengan menggunakan sequen DNA ALFexpress Urutan nukleotida dan perbandingan asam amino dilakukan dengan menggunakan Clustal W .untuk menkonstruksi pakai DNAMAN digunakan untuk membangun pohon homologi. Analisis Southern blot DNA genom dari X. viscosa diisolasi menggunakan DNA tanaman DNA hasil isolasi dipotong2 denganEcoRI, XhoI, BglII, HindIII dan EcoRV, dielektroforesis Dilakukan blothing pada membran nilon cDNA Lengkap dari XVSAP1 dilabel dgn (DIG) , selanjutnya dihibridisasi pada potongan DNA, hasilny diamati menggunakan the ceniluminescanl.

Stres induksi (Stress induction) Tanaman X. Viscosa ditumbuhkan pada kondisi stress, salinitas tinggi Untuk mengetahui apakah ABA berpengaruh pada ekspresi XVSAP1, daun disemprot dgn ABA didehidrasi dengan pengurangan air untuk periode dari 2 minggu. Daun yang terlepas dari tanaman sebesar 90%, 78%, 63%, 51%, 44%, dan 4% RWC. Sampel daun juga dikumpulkan pada 4%, 32%, 42%, 85%, dan 92% pada RWC kembali hydrating. Untuk panas perbaikan tanaman sepenuhnya terhidrasi disimpan dalam phytotron pada 42 ° C (Kelembaban 50 - 70%, 16/8 jam siklus terang / gelap). Tanaman yang disiram secara teratur untuk menjaga mereka di hidrasi penuh. Untuk mengetahui pengaruh stres dingin, tanaman disimpan pada suhu 4 ° C dan sampel daun diambil setiap 6 jam untuk 60 jam. Untuk menguji respon X. viscosa terhadap salinitas tinggi, tanaman irigasi dengan 100 mM NaCl sehari selama 7 d. Cahaya tinggi perbaikan dilakukan dengan mengekspos tanaman terhadap cahaya pada 1500 mmol m - 2 s - 1 untuk 4 d dalam phytotron (25 ° C, kelembaban 50 - 70%). Tanaman diirigasi dengan air setiap hari untuk menjaga mereka terhidrasi sepenuhnya. Untuk menentukan apakah asam absisat (ABA) memiliki efek pada ekspresi XVSAP1, X. daun viscosa disemprot dengan phytohormone di sebuah konsentrasi 100 mM dalam air sekali setiap 24 jam. Dalam semua kasus, daun Sampel diambil dari tanaman percobaan sebelum perawatan dimulai (waktu 0). Sampel dikumpulkan setiap 24 jam setelah itu kecuali untuk perbaikan dingin, di mana sampel dikumpulkan setiap 6 jam. Dalam kasus ABA, sampel diambil setiap 3 jam setelah perbaikan daun. Semua sampel daun dikumpulkan dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada -70 ° C sampai digunakan lebih lanjut.

Isolasi RNA (RNA isolation) RNA total diisolasi dengan menggunakan reagen Trizol (Gibco-BRL). daun X. viscosa (200 mg) RNA dipisahkan dari kotoran dgn di running pada agarose formaldehide dan di cat dgn etidium bromida Setelah inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar, 0,2 ml kloroform ditambahkan diikuti oleh sebuah inkubasi lebih lanjut pada suhu kamar selama 10 menit. Sampel disentrifugasi pada 12 000 g selama 10 menit pada 4 ° C dan RNA diendapkan dengan menggunakan isopropanol. RNA kuantitatif dinilai dgn spektrofotometri, dipisahkan pada 1,2% agarosa gel formaldehid dan diwarnai dengan etidium bromida untuk memverifikasi kuantisasi. Semi- kuantitatif RT-PCR RNA diambil dari agarose, direaksikan dgn DNAse untuk menghilangkan DNA kontaminan Dilakukan transkripsi balik dari RNA menjadi DNA, menggunakan Omniscript reverse transcriptase kit Selanjutnya cDNA yg terbentuk di PCR dgn potongan primer Setelah PCR, sampel diselesaikan dengan elektroforesis pada 0,8% gel agarosa dan diwarnai dengan etidium bromida.

Hasil E coli+plasmid+ XVSAP1 E coli+plasmid Gambar. 1. Analisis pertumbuhan E. coli (srl :: Tn10) sel berubah dengan protein prokariotik vektor ekspresi pPROEXHT (lingkaran terbuka) dan sel-sel ditransformasi dengan pPROEXHT-XVSAP1 (lingkaran tertutup) di Media minimal. Ekspresi XVSAP1 diinduksi dengan IPTG pada waktu nol. Sel-sel dibiarkan tumbuh selama 2 jam sebelum sorbitol ditambahkan ke konsentrasi final dari 1 M. Sampel diambil pada interval dan absorbansi pada 600 nm ditentukan. Error bar mewakili standar deviasi berdasarkan rata-rata rangkap tiga sampel. E Coli tdk dapat tumbuh pada media dgn sorbitol tinggi, cDNA diklon ke plasmid pPRO…, transformasi ke E Coli, E Coli ditumbuhkan dimedia+ sorbitol

42-47 149-154 239-249 Gambar. 2. (A) sekuens asam amino nukleotida dan menyimpulkan dari XVSAP1. Awal dan stop kodon ditunjukkan dengan shading. Nmyristoylation Situs ini ditunjukkan dengan garis putus-putus dan situs prokariotik membran lipoprotein lipid lampiran digaris bawahi oleh garis tebal. Daerah dari enam heliks transmembran ditunjukkan dalam huruf tebal. (B) Sebuah profile hidrofobik dari XVSAP1 protein yang ditentukan oleh metode Kyte dan Doolittle (1982) menggunakan jendela 19 residu asam amino. Keenam domain transmembran diduga ditunjukkan oleh Roman angka

XVSAP1 identik 49% dgn WCOR413 protein tahan dingin gandum, 25-56% identik dgn “cold “padi. XVSAP1 identik 70% dgn ATCAP arabidopsis Gambar. 3. (A) Perbandingan deduksi urutan asam amino dari protein yang terkait dengan XVSAP1. Protein adalah WCOR413 (GenBank Aksesi No T06810), protein dingin diatur dari gandum, protein yang terkait dingin (-4 ATCAP1: GenBank Aksesi Nos T08404, AAD41971, CAB16776, dan T02423, masing-masing) dari Arabidopsis dan Oryza sativa dingin aklimasi WCOR413-seperti protein (RCAP: GenBank Aksesi Nomor AAG13395). Hanya protein Arabidopsis menunjukkan homologi tertinggi yang akan ditampilkan. Persentase mengikuti urutan menunjukkan identitas persen untuk XVSAP1. Residu asam amino identik ditandai dengan tanda bintang. Asam amino yang serupa ditunjukkan oleh poin. (B) Homologi pohon untuk XVSAP1 dan terkait protein.

Enzim beda pola hibridisasi beda, ex Enzim beda pola hibridisasi beda, ex. Pada jalur 2 ada pita yg menunjukkan hibridisasi, probe XVSAP1 cDNA. Menunjukkan ada multiple copies dari XVSAP1 dalam X viscosa Gambar. 4. Analisis Southern blot DNA genom dari X. viscosa.15 mg DNA dipotong dengan EcoRI / XhoI (jalur 1), BglII (jalur 2), HindIII (Jalur 3), dan EcoRV (jalur 4), dielektroforesis pada gel agarose 1%, ditransfer ke membran nilon dan diperiksa dengan DIG-label XVSAP1 cDNA.

Gambar. 5. Ekspresi XVSAP1 transkrip selama dehidrasi dan rehidrasi X Gambar. 5. Ekspresi XVSAP1 transkrip selama dehidrasi dan rehidrasi X. viscosa ditentukan dengan menggunakan RTPCR semi-kuantitatif. PCR produk divisualisasikan pada gel agarosa diwarnai dengan etidium bromida. Produk XVSAP1 asli adalah 830 bp dan pesaing 345 bp. M mengacu pada jalur penanda. Persentase mengacu kadar air relatif (RWC). (A) Tanaman X.viscosa dehidrasi dari 90% sampai 4% RWC , RWC oleh air pemotongan untuk jangka waktu 2 minggu. (B) Tanaman X.viscosa yang direhidrasi lebih dari 5 d dengan penyiraman. (C) Variasi RWC selama dehidrasi -hidrasi X. viscosa.

Gambar. 6. Induksi XVSAP1 oleh panas, NaCl, intensitas cahaya yang tinggi, dan perlakuan suhu rendah di X. Viscosa menggunakan semiquantitative RT-PCR. PCR produk divisualisasikan pada gel agarosa diwarnai dengan etidium bromida. Produk XVSAP1 asli adalah 830 bp dan 345 bp pesaing. M mengacu pada jalur penanda. (A) Tanaman disimpan dalam inkubator 42 ° C selama 7 d untuk menginduksi stres panas. (B) Salt stress diinduksi dengan mengairi tanaman pot dengan 100 mM NaCl. (C) Tanaman yang terkena cahaya tinggi pada 1500 mmol m -2 s -1 untuk 4 d dalam phytotron (25 ° C, kelembaban 50 - 70%) untuk perbaikan cahaya tinggi (D) perlakuan dingin dicapai dengan menjaga tanaman pada suhu 4 ° C selama 60 jam.