Dasar-dasar Pengklonan gen Drs. Sutarno, MSc., PhD.

DASAR-DASAR PENGKLONAN GEN Pengklonan gen mempunyai beberapa tujuan: memperoleh gen sebagai penelusur mendapatkan gen untuk dianalisis urutan nukleotidanya mendapatkan gen untuk diekspresikan pada sel inang.

Tahap-tahap dalam pengklonan gen: Membuka sel hidup.  untuk sel mammalia, biasanya dg memblender sel kemudian ditambahkan deterjen. Mengambil informasi genetik (DNA) dari sel, dengan teknik pemurnian DNA, Mememotong gen khusus yang diinginkan dengan Enzim Restriksi. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam perantara yang disebut cloning vehicle (vektor) yg akan membawa potongan DNA ke dalam sel hidup lain. Vektor  molekul DNA yg relatif pendek yang dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel. Penyambungan menghasilkan molekul DNA kimera (rekombinan/ vektor rekombinan).

Tahap-tahap dalam pengklonan gen: 5. Vektor yg mengandung potongan khusus DNA dimasukkan ke dalam sel inang, biasanya organisme monoselluler seperti bakteri atau ragi. 6. Membiarkan sel inang untuk memperbanyak diri membentuk klon sel identik yang jumlahnya sangat besar. Di dalam sel inang, vektor rekombinan memperbanyak diri sehingga gen yg tersisip juga mengalami amplifikasi. Bila sel inang memperbanyak diri, gen tersisip pada rekombinan vektor juga mengalami penggandaan diri.

Skema rekombinan DNA Sumber DNA Vektor kloning DNA target Linearisasi enzimatik Fragmentasi enzimatik DNA vektor Gabungkan DNA target dengan Vektor kloning DNA construct Masukkan ke sel host Pisahkan sel yg mengandung insert Sel host (eg. Bakteri) Produksi protein Protein yg dikodekan oleh insert gen

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER Vektor: pembawa molekul DNA dlm proses pengklonan gen. Vektor yang biasa digunakan: Plasmid, Fage, kromosom buatan dr khamir (YAC= yeast artificial chromosome), dan Cosmid. Plasmid biasa digunakan untuk membawa molekul DNA berukuran kecil, sedangkan untuk molekul DNA yang besar digunakan fage, cosmid atau YAC.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 1. PLASMID Merupakan DNA utas ganda sirkuler berukuran kecil yg terdapat di dlm sitoplasma dan dpt melakukan replikasi secara otonom. Ciri penting plasmid: 1. Dapat melakukan replikasi, 2. Tdp diluar kromosom , 3. Secara genetik dpt ditransfer secara stabil. Tdp secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yg disesuaikan dg keperluan didlm manipulasi genetik. Satu sel dpt mengandung lebih dr satu kopi. Plasmid tdp dlm sitoplasma prokryot maupun eukaryot seder hana uniselluler. Selain pada bakteri, plasmid juga tdp pd Saccharomyces cereviceae.

Plasmid dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yg dikandungnya: Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yg bertanggung jawab thd proses konjugasi Plasmid R (resistensi) mengndung gen resistensi thd antibiotik atau logam berat Plasmid yg mengandung gen penyandi toksin dan bakteriosin, seperti ColE1 dari E.coli. Plasmid degradatif yg mempunyai kemampuan utk melakukan metabolisme molekul organik spt toluen (TOL dr Pseudomonas putida).

Untuk kloning gen, plasmid yg ideal bersifat: Plasmid virulensi: yg bertanggung jawab thd patogenositas dr sel inang (pTi pd Agrobacterium tumefaciens). Untuk replikasi, plasmid dpt dlm keadaan: terpisah dari kromosom (non-integratif), dan ada yg terintegrasi ke dlm kromosom bakteri (episom). Untuk kloning gen, plasmid yg ideal bersifat: a). berukuran kecil, b). minimal memiliki satu situs penyisipan yg mudah diidentifikasi, dan c). membawa sifat yg mudah utk seleksi bagi inang yg mengandungnya. Efisiensi transformasi berbanding terbalik dengan ukuran plasmid, semakin kecil ukuran plasmid efisiensi transformasi semakin besar.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 2. FAGE Fage atau bakteriofage adalah virus yg menginfeksi bakteri. Struktur fage sangat sederhana, tersusun dr molekul DNA yg membawa beberapa gen dan molekul protein yg membungkusnya yg disebut dg Kapsid. Tdp 2 macam siklus hidup fage: 1). Siklus litik, dan 2). Siklus lisogeni. Siklus litik diakhiri dg pelepasan fage baru dr bakteri inang karena tjd lisis, sedangkan pd lisogeni, DNA fage tersisip di dlm kromosom bakteri yg berfungsi sgb sel inangnya.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 3. COSMID Vektor yg diturunkan dr plasmid yg mengandung ujung kohesif (cos) dari fage . Merupakan molekul DNA hibrid antara fage  dan plasmid bakteri. Di dlm bakteri, cosmid membentuk molekul sirkuler spt halnya plasmid, dan tdk dapat melisis sel ingnya krn tidak (atau sedikit sekali) mengandung gen .

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 4 VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 4. KROMOSOM BUATAN KHAMIR (YEATS ARTIFICIAL CHROMOSOME, YAC). Diperlukan dalam pengklonan DNA yg ukurannya besar. Pada beberapa gen eukaryot, tdp gen yg ukurannya sangat besar seperti Cyztic fibrosis pada manusia yg besarnya 240kb, sehingga baik plasmid, fage maupun cosmid tidak bisa digunakan sebagai vektor.

INTRODUKSI VEKTOR KE DALAM SEL INANG Agar dapat mengalami penggandaan, vektor rekombinan diintroduksikan ke dalam sel inang. Penggandaan vektor  DNA tersisip juga mengalami penggandaan  klon dari DNA sisipan. Introduksi vektor rekombinan dibedakan menjadi 2: 1. Transformasi, bila vektor yg digunakan adalah plasmid, dan 2. Transfeksi, bila virus dan turunannya yg digunakan sebagai vektor.

Transformasi pd bakteri biasa dilakukan dengan menggunakan bahan kimia atau menggunakan aliran listrik (fisik). Agar DNA bisa masuk dlm bakteri, dinding dan membran bakteri dibuat sedemikian rupa shg DNA dapat melewati membran (rentan  kompeten), dengan penambahan kation Ca atau Mg dan penambahan detergen (eg Triton X). Kombinasi perlakuan kimia dan fisik seperti heat shock pada suhu 42oC selama 1-2 menit sering dilakukan. Kejutan listrik (elektroporasi) dg tegangan tertentu dlm waktu relatif singkat, membran sel inang akan terbuka membentuk pori. Cara lain utk sel eukaryot transfer gen secara langsung dengan menggunakan protoplast dan mikroinjeksi.

Contoh Kloning pd domba

Cloning phenotypic similarities among clones genetic identical have same environmental variance that would normally be present will not perform in identical manner greater similarity could be useful in research applications reduced variance not a likely benefit for livestock, at least in near term