Bio-mol kul ke 10-11 Erlindha Gangga A Rekayasa genetika Bio-mol kul ke 10-11 Erlindha Gangga A

Untuk mempelajari kloning gen dibutuhkan penge -tahuan tentang konsep biologi molekuler dan peng -gunaan tehnik-tehnik dalam laboratorium Teknologi DNA telah meluncurkan revolusi dalam bidang bioteknologi yaitu manipulasi organisme atau komponen organisme untuk melakukan tugas tugas praktis untuk menghasilkan produk yang bermanfaat. Semuanya melibatkan para peneliti dari bidang a.l; biologi, mikrobiologi, biologi molekuler,dan para teknisi peralatan untuk menunjang kerja para peneliti.

KEMAMPUAN YANG REVOLUSIONER DARI REKAYASA GENETIKA Teknik ini menjanjikan berbagai kemampuan yang revolusioner, antara lain : Cepat Dapat diterapkan secara universal Dapat dilakukan pengendalian yang ketat terhadap proses manipulasi Dapat membentuk berbagai kombinasi genetik baru yang belum diseleksi sebelumnya dengan metode laboratorium

Cara / Garis besar kloning gen : 1. Membuka sel hidup. Untuk ini terdapat beberapa cara, yang popular adalah dengan memblender sel dan kemudi- an menambahkan deterjen ( untuk sel mamalia ). 2. Mengambil informasi genetic ( DNA ) dari sel. Karena mole- kul DNA ratusan kali lebih panjang dari molekul lain dalam sel, maka tehnik pemurnian DAN mudah dikembangkan. 3. Salah satu metodanya adalah dengan menggulung DNA pada sebatang gelas. Batang gelas yang membawa DNA kemudian diangkat dari campuran sel-sel pecah, dengan cara seperti kita mengangkat bakmi dengan sumpit.

4. Memotong gen khusus yang diinginkan. Metode ini dilakukan dengan cara seperti meng -edit film. Seperti halnya film, DNA juga terdiri atas ”frame” untuk menunjukkan urutan yang tepat. Dalam DNA ”frame” ini merupakan susunan huruf kode genetik. Bila frame-frame ini disusun pada kombinasi tertentu, akan menjadi cerita pada film atau menjadi DNA pada gen. Gunting molekuler untuk memotong DNA adalah suatu enzim yang disebut restriction enzym ( enzim pemotong ).

5. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam perantara yang disebut cloning vehicles yang akan membawa potongan DNA ke dalam sel hidup lain. o. Cloning vehicles adalah molekul DNA yang relatif pendek yang dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel. o. Menempatkan gen khusus pada kloning vehicle mi rip seperti menyambung adegan cerita dalam film pendek. o. Proses penyambungan menghasilkan chimeric DNA molekul ( molekul DNA kimera ), Sebagian adalah gen khusus dan bagian lainnya adalah gen dari cloning vehicle tersebut. o. Molekul DNA tersebut juga disebut recombinant DNA molekul ( molekul DNA rekombinan).

Cloning vehicle yang mengandung potong- an khusus DNA tadi dimasukkan ke dalam sel inang yang biasanya adalah organisme sel tunggal ( seperti bakteri atau ragi ). membiarkan sel inang untuk memperbanyak diri membentuk klon dengan kandungan bermilyar milyar sel yang identik.

Pada umumnya kloning sederhana dari sepotong DNA berlangsung baik Pada umumnya kloning sederhana dari sepotong DNA berlangsung baik. Seperti halnya film yang menjadi berguna setelah diproyeksikan. Demuikian juga informasi dalam DNA yang harus dirubah kedalam produk yang berguna. Untuk membuat produk, informasi dalam DNA ditransfer dari gen ke tempat molekul protein diproduksi. Pembuatan produk berdasar informasi yang disimpan dalam DNA disebut ekspresi gen.

Yang harus kita ketahui, protein adalah rangkaian molekul yang terdiri dari ratusan mata rantai asam nukleat. Suatu tipe dari fungsi protein sebagai balok penyusun struktur sel, dan tipe lain yang berfungsi untuk mengontrol reaksi-reaksi kimia dalam sel.

Sebelumnya, insulin didapatkan dengan cara memurnikan protein pankreas babi. Tetapi sekarang dengan tehnik kloning gen, yaitu : memindahkan gen insuling manusia ke dalam sel bakteri. Dengan demikian akan didapatkan produksi insulin dalam jumlah besar oleh bakteri, cara ini lebih mudah

Contoh tehnik rekombinan : pembuatan insulin dengan perantara bakteri. Insulin adalah hormon yang dibutuhkan untuk mengontrol metabolisme gula dalam tubuh kita. Pada penderita penyakit kencing manis (diabetict) terjadi kegagalan dalam mensintesa hormon ini sehingga diperlukan penambahan insulin dari luar untuk kelangsungan metabolisme gula dalam tubuh.

TINGKAT KEBERHASILAN KLONING : Dipengaruhi oleh : Pemilihan Vektor Pemilihan sistem kloning, tergantung pada penentuan tujuan yang ingin dicapai. Tujuan dari kloning fragmen DNA Isolasi dan perbanyakan fragmen DNA murni Preparasi pelacak DNA atau RNA dari urutan spesifik Sequencing daerah penting pada berbagai genom Ekspresi dan pemurnian sejumlah protein biologis Modifikasi genetik species Modifikasi in Vitro dari urutan DNA yang bermanfaat

Garis besar kloning gen : Membuka sel hidup, dengan cara memblender , skuensing dan destruksi ( memecah sel ). Mengambil informasi genetik ( DNA ). Karena molekul DNA panjangnya ratusan kali molekul lain didalam sel. Memotong gen (DNA) khusus yang diinginkan menggunakan enzim restriksi. Menempatkan potongan DNA spesifik kedalam perantara yang disebut “cloning vehicles “ yang akan membawa DNA ke sel hidup yang lainnya. “cloning vehicles “

Perangkat Teknik DNA Rekombinan / Rekayasa Genetika : Enzim restriksi Vektor / wahana kloning Konstruksi dan pengklonan Konjugasi, transformasi, transduksi

Enzim Restriksi ▲ Adalah : Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan / pe motongan DNA dibeberapa tempat / lokasi spesifik dengan jumlah yang terbatas & dapat direproduksi. ▲ Enzim ini disebut juga dengan nama endonuklease restriksi ( Russell, 1980). ▲ Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester asam nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan target umumnya sering muncul berkali kali. ▲ fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda dengan sedikitnya satu ujung untai tunggal.

Sejarah penemuan enzim restriksi Stewart Linn & Werner Arber (1960) Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim nuklease “restriksi” dalam bakteri E.coli galur B yang dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan. Hamilton Smith (1970) Pertama kali menemukan enzim nuklease restriksi spesifik yang memutus DNA pada tempat- tempat tertentu dan dapat diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzae yang dikenal dengan nama HindII,

Watson dkk, (1983) Menemukan nuklease restriksi & metilase modifikasi dalam dua galur E.coli lain yang membuka kemungkinan adanya banyak nuklease yang spesifik untuk suatu tempat

Enzim gol 1 Enzim Restriksi terdiri dari 2 golongan Memecah DNA pada tempat yang tidak spesifik, jauh dari tempat pengolahan. Mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik. Antara lain : enzim-enzim yang terlibat dalam sistem restriksi K dan B ( termasuk E.Coli)

Enzim gol 2 Memecah DNA pada tempat yang spesifik. Telah banyak diisolasi dari mikroorganisme (Russell, 1980). Enzim yang pertama kali ditemukan pada tahun 1970 oleh Hamilton Smith dari Universitas John Hopkens yaitu : Haemophyllus influenza, yang dapat segera menguraikan pemakan DNA asing.

Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

Vektor / Wahana kloning ♦ Seutas molekul DNA tunggal tempat dilekatkannya material genetik yang kita inginkan sebelum di injeksikan ataupun ditransformasikan kedalam bakteri tertentu. ♦ Wahana kloning yang paling sering di gunakan adalah plasmid.

Plasmid Adalah unsur genetik diluar kromosom ( ekstrakromosomal), yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNAnya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda. Mendukung gen yang diperlukan untuk replikasi ataupun fungsi lain yang dipikulnya. Plasmid mudah dipisahkan dan dimurnikan dari DNA inang Pada Rhizobium sp. plasmid berguna karena terlibat dalam proses fiksasi dan untuk mengikat nitrogen.

Adalah molekul yang dapat diturunkan secara stabil tanpa mengkaitkannya dengan kromosom. Sangat berarti bagi bidang kedokteran , farmasi, dan pertanian , karena plasmid membawa resisten terha dap antibiotik yang berguna bagi manusia dan hewan. Selain itu dapat menjandikan toksin dan protein lain yang dapat meningkatkan virulensi patogen.

Jenis plasmid Plasmid F : Plasmid faktor R : Plasmid Ti : Berfungsi dalam proses konjugasi dan dikenal pada berbagai bakteri. Plasmid faktor R : Plasmid yang membawa gen-gen penyebab resistensi terhadap antibiotik. Plasmid Ti : Pada berbagai Agrobacterium Fungsi berhubungan dengan tumbuhan inang, yaitu dengan cara mentransfer satu fragmen DNA (DNA-T) kedalam sel inang, yang kemudian akan menyebabkan tumbuhnya tumor pada inang.

Fungsi plasmid Mendukung replikasi Sebagai vektor untuk pengklonan DNa Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten ) Contoh : plasmid resisten  p BR. 322.( plasmid R.E Coli , yaitu : plasmid yang memberi resisten terhadap ampicilin dan tetrasiklin. ) ♦ DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara “melisiskan” sel bakteri dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom. ♦ Plasmid p.BR.322 : merupakan suatu determinan replikasi plasmid pMBI yang berkaitan dengan col.E.I. gen plasmid RI ( TN3) resisten dan gen resisten tetrasiklin plasmid pS (101) sebagai penanda seleksi.

Plasmid

Plasmid resisten

. Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri

Pemindahan plasmid kedalam gen

Vektor plasmid & Ciri plasmid

Kuliah ke11 Konstruksi dan Pengklonan ¤. Pengisolasian DNA sumber gen dan vektor Isolasi DNA sebagai sumber gen menggunakan enzim endonuklease. diperoleh dari gen yang diinginkan yang kemudian ditumbuhkan / dikultur kan dalam laboratorium. Isolasi plasmid dari bakteri (E.coli ) yang membawa 2 gen penanda e.g. 1. Resistensi terhadap antibiotik ampisilin, 2. Lac Z yang mengkode β.galaktosidase yang dapat menghidrolisis laktosa.

¤. Penyelipan DNA kedalam vektor ( 3 langkah) 1. Memotong DNA yang ingin diselipkan dan DNA plasmid dengan enzim restriksi yang sama. Pada saat pemotongan enzim restrik si membuat / menciptakan ujung ujung leng- ket dari kedua DNA. 2. Menyatukan kedua utas DNA dimana ke 2 ujung lengket akan berpasangan 3. Menggabungkan molekul molekul DNA secara ikatan kovalen menggunakan enzim Ligase.

¤. Pemasukan vektor kedalam sel Sel bakteri akan mengambil plasmid dengan cara trans formasi (penyerapan DNA dari larutan disekelilingnya). ¤. Pengklonan sel- sel ( gen DNA asing) Dalam proses ini bakteri yang telah mengandung plasmid rekombinan ditempatkan dalam nutrien agar yg mengandung ampisilin dan x- gal ( gula). Bakteri akan bereproduksi yang membentuk koloni sel rekombinan. yang mengandung sel rekombinan resisten antibiotik ampisilin dan gen lak Z.

¤. Identifikasi klon gen rekombinan. Dengan metode hibridisasi asam nukleat : menggunakan utas DNA / RNA yang pendek dapat diketahui urutan basanya disebut probe asam nukleat. Probe asam nukleat diberi label radio isotop sehingga pada saat penelusurun dapat dilihat DNA klon yang komlementr dengan DNA probe yang berikatan hidrogen secara spesifik.

PCR ( Polymerase Chain Reaction) Adalah suatu teknik / metode dimana setiap fragmen DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa menggunakan sel. PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer karena DNA polimerase akan menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang sudah ada sebelumnya dengan bantuan primer.

Manfaat PCR Memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah Kerjanya sangat spesifik dan ampuh. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrio -nik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.

Analisis DNA Hasil Klon Electroforesis Southern Blotting Metode Sanger.

Aplikasi DNA Rekombinan Dalam Bidang Kedokteran Dalam Bidang Farmasi Dalam Bidang Forensik Dalam Bidang Lingkungan Dalam Bidang Pertanian Dalam Bidang pangan

Konjugasi, transformasi, transduksi Perpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya secara kontak antar sel. Sel donor akan memberikan informasi genetik kepada resipien. Plasmid akan mengontrol formasi filamen permukaan sel yang dibutuhkan untuk mengadakan kontak pada waktu terjadinya perkawinan.

Plasmid memiliki sistim khusus untuk replikasi dan transfer DNA plasmid dan sistem pengontrolan Plasmid memiliki faktor F yang merupakan faktor konjugatif ,

Transformasi Prosesperpindahan genetik dimana sel resipien membutuhkan molekul DNA bebas ( DNA yang berada diluar sel atau yang telah dimurnikan. Dalam laboratorium transformasi dapat dilakukan dengan mengisolasi DNA donor kemudian menambahkannya pada suspensi selresipien. Transformasi dapat terjadi secara alami.

Pada prinsipnya transformasi akan terjadi bila sel resipien mampu menerima DNA yang telah diisolasi dari sel donor. Transformasi dapat terjadi pada bakteri Gram positif ataupun Gram negatif Transformasi dapat dipindahkan dari sel bakteri kepada sel tanaman.

Transduksi Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh virus dari sel inang . Transduksi terbagi 2 Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa virus tertentu.gen inang langsung diintegrasi kedalam genomvirus.lalu ditransfer ke resipien selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen ) Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga lengkap

Transduksi umum : gen gen inang yang berasal dari suatu genom akan menjadi bagian dari partikel DNA virus yang sudah matang darisuatu tempat atau penambahan pada genom virus. Virus yang telah mengalami transduksi tidak mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel bakteri telah menggantikan tempat penting pada gen virus.