Fumarate hydratase (EC. 4.2.1.2) Amalina Ghaisani Komarudin 10507008 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung

Agenda Presentasi Pendahuluan Struktur Fumarase Mekanisme Fumarase Isolasi Fumarase Pemurnian Fumarase Karakterisasi Fumarase Kinetika Fumarase Defisiensi Fumarase

Pendahuluan Siklus Krebs

Reaksi yang Dikatalisis Reaction: (S)-malate = fumarate + H2O

Tata nama enzim Fumarase EC 4 : Lyase EC 3.1 : Carbon-Oxygen Lyase EC 3.1.1 :Hydro-Lyase Accepted name: Fumarate Hydratase Fumarase (EC. 4.2.1.2) Hydro Lyase Lyase Carbon-Oxygen Lyase

Penggolongan Enzim Fumarase Class I Fumarase A, Fumarase B Class II Fumarase C Klasifikasi berdasarkan penyusunan subunit, kebutuhan logam dan ketermostabilan. Prokaryot memiliki tiga jenis Fumarase : Fumarase A, Fumarase B dan Fumarase C

Struktur Fumarase C dari E.coli Terdiri dari tiga domain, dimana posisi region 1-3 berjauhan Memiliki dua buah dicarboxylate binding site yaitu A site dan B site A site dan B site teridentifikasi memiliki area yang tidak terisi ligan

Residu pada sisi aktif Fumarase

Mekanisme Enzim Fumarase

Isolasi Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris E. gracilis + buffer 1 (50 mM triethanolamine-HCl pH 7.8 + malate 10 mM 5 mM EDTA 10 mM 2-mercaptoethanol Diisolasi dari sel yang kekurangan vitamin B-12 menggunakan metode Trypsin digestion Dimurnikan dengan sentrifugasi gradien densitas Fumarase

Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris + 70 mL buffer French pressure cell pada 10.000 lb/in2 Sentrifugasi 27.000 x g selama 30 menit Crude extract 50 g sel Dipanaskan pada suhu 50o C selama 3,5 menit Sentrifugasi pada 27.000 x g selama 20 menit Supernatan pH dibuat menjadi 7.8 dengan 2 M triethanolamine Fraksinasi dengan amonium sulfat 40 % dan 60 % Ekstrak enzim

Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. Bacillaris (lanjutan) Dialisis dengan bufer selama 3 jam Sentrifugasi Supernatan Hasil fraksinasi Ditambah NADH, NAD+, NADPH, NADP+ Kromatografi afinitasMatrix gel Orange A Karakterisasi Fumarase

Karakterisasi Fumarase Aktifitas enzim + 2 mL 50 mM potassium phospate + 50 mM malat Diukur serapan pada l 250 nm( 1 Unit enzim = 1 mmol fumarat/menit) Berat molekul SDS-PAGE (gel 10%) Native-PAGE

Hasil elektroforesis

Parameter kinetika Enzim Fumarase Aktivitas maksimum pada pH 8,4 Km Malat = 0,14 mM Km Fumarat = 0,031 mM ATP merupakan inhibitor Pada 10 mM Tris-acetate (pH 7.3) dan konsentrasi malat= 1 mM, 32,2 mU E. gracilis fumarase terinhibisi 50% oleh 0,35 mM ATP.

Defisiensi Enzim Fumarase Defisiensi fumarase disebabkan oleh mutasi gen yang mengkode fumarase Kekurangan Fumarase menyebabkan ensefalopati, retardasi mental yang berat, fitur wajah yang tidak biasa, kelainan otak, dan serangan epilepsi karena jumlah abnormal rendah fumarase dalam sel. Pola penurunan penyakit ini adalah autosomal resesif

Referensi Purification, Characterization and Immunological Properties of Fumarase from Euglena gracilis var. Bacilaris. Hitoshi Shibata, William E. Gardiner, Steven D. Schwartzbach. Journal of Bacteriology, Nov. 1985, P. 762-768 The role of the allosteric B site in the fumarase reaction. Irwin A. Rose and Todd M. Weaver. www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0307524101 Structure of Free Fumarase C from Escherichia coli . Todd Weaver. Acta Cryst. (2005). D61. 1395-1401

SEKIAN DAN TERIMA KASIH