KI 6161 – ENZIMOLOGI Laccase: Sifat dan Aplikasinya Aisyah (10509057) Bunga Annisa (10509089)

Struktur dan Sifat Molekular Pemurnian, Kinetika dan Modifikasi Agenda Presentasi Laccase Struktur dan Sifat Molekular Sumber dan Isolasi Pemurnian, Kinetika dan Modifikasi Aplikasi

Struktur & Sifat Molekular Laccase (EC 1.10.3.2) Enzim oksidoreduktase yang bekerja pada substrat difenol sebagai donor Memiliki gugus 1,4-benzendiol dan 4 atom tembaga per monomer Cu tipe 1  tempat substrat tereduksi Cu tipe 2 & 3  pusat trinuklir yang mengikat oksigen

Mekanisme katalisis Laccase Radikal bereaksi dengan Laccase/ nonenzimatik Substrat tereduksi radikal bebas O2 teroksidasi  H2O e- ditransfer dari T1 T2 T3 Laccase menyerang gugus fenolik substrat Mekanisme katalisis Laccase Katalisis substrat non-fenolik: Bantuan mediator HOBT, NHPI, ABTS dan 3-asam hidroksianthranilik

Sumber Laccase TANAMAN -pembentukan lignin, pigmen dan badan buah -detoksifikasi -pathogenesis tanaman BAKTERI S.Lavendulae S.Cyaneus Marinomonas mediterranea JAMUR -Morfogenesis dan diferensiasi saat sporulasi -Kadar tinggi Cth: Basidiomycetes dan Saprotrophic SERANGGA Bombyx, Calliphora, Diploptera, Drosophila, Lucilia, Manduca, Musca, Oryctes, dll

Isolasi dan Pemurnian Laccase Jamur (Basidiomycetes /Saprotrophic) Dihancurkan Digiling Sub-kultur Kultur Murni diinokulasi pada medium padat Diuji dengan α-naftol Kompleks ungu gelap (oksidasi α-naftol oleh Laccase) Produksi Laccase Pemurnian ultrafiltrasi penukar ion gel filtrasi interaksi hidrofobik elektroforesis Kromatografi

Produksi Laccase C: glukosa, mannosa, maltosa, fruktosa, dan laktosa N: yeast extract, pepton, urea, (NH4)2SO4, dan NaNO3 Pembatasan jumlah C dan N  peningkatan Laccase Sumber C dan N Berkisar antara 25o-30oC Pra-inkubasi 40oC-50oC meningkatkan aktivitas Laccase Temperatur Medium dengan pH 4.5-6.0 produksi Laccase yang tinggi pH

Produksi Laccase (Cont) Menyebabkan miselia jamur rusak  turunnya produksi Laccase, Pengadukan Senyawa xenobiotik/ logam berat (2,5-xilidin, lignin, veratril alkohol)  meningkatkan dan menginduksi aktivitas Laccase. Inducer Submerged Fermentation, mikroorganisme ditumbuhkan dalam medium cair bernutrisi dengan konsentrasi O2 tinggi Solid-State Fermentation, meniru kondisi alami tumbuh jamur, menggunakan substrat alami Tipe Kultivasi

Kinetika Penentuan  mengukur laju pembentukan substrat teroksidasi Bergantung terhadap jenis substrat Contoh : Trametes hirsuta dengan substrat ABTS ABTS teroksidasi diukur jumlahnya menggunakan spektrofotometer.

Kinetika (Cont.) Faktor yang mempengaruhi aktivitas Laccase pH optimum Sangat bergantung pada substrat substrat fenol : antara 3-7 (dari jamur), di atas 9 (dari tumbuhan) subtrat ABTS :antara 3-5 pH optimum Temperatur optimum Anion kecil (halida, azida, sianida, dan hidroksida) menghasilkan gangguan terhadap transfer elektron Asam tioglikolik, dietiltiokarbamat, ion logam, asam lemak dan reagen sulfuhidril juga menurunkan aktivitas Laccase Inhibitor

Modifikasi Dengan PEG (polietilen glikol) Menurunkan adsorpsi enzim pada polimer Direaksikan secara kovalen dengan PEG Akibat  Mr, stabilitas, nilai K/S (spesifisitas) meningkat, afinitas substrat terhadap enzim menurun Dengan PEG (polietilen glikol) Bersifat tidak larut  dapat menjadi intermediet Meningkatkan aktivitas Laccase Dengan Linear-Dendritic Copolymers

Modifikasi (Cont) Modifikasi dengan Pembentukan Immobilized Laccase Pembentukan dalam multiwalled carbon nanotube (MWNT) termodifikasi Menyiapkan komposit elektro-katalis untuk reduksi O2 yang sangat aktif Modifikasi dengan Pembentukan Immobilized Laccase Perbandingan parameter kinetika Free Laccase dan Immobilized Laccase

Modifikasi (Cont.) Modifikasi dengan Mutasi Meningkatkan aktivitas oksidasi Mendesain beberapa mutasi 1 titik pada asam amino yang berikatan dengan sisi aktif substrat Pada laccase Trametes versicolor : SDM dilakukan pada fenilalanin 162, 265, 332, & 337 digantikan dengan asam amino nonpolar yang lebih kecil Mutasi double F162A/F332A dapat mengoksidasi substrat bisfenol mutasi paling efektif Modifikasi dengan Mutasi

Peran Laccase Industri Kertas Industri Makanan Industri Tekstil Proses pemisahan dan degradasi lignin dalam pembuatan kertas Pengganti oksidan kimia berbasis Cl dan O2 yang mahal, toksik, dan sulit didaur ulang. Industri Makanan Menghilangkan senyawa fenolik yang mengubah aroma dan warna karenapolimerisasi dan oksidasi Contoh: proses pembakaran, pembuatan jus, stabilisasi wine, dll. Industri Tekstil mencegah pewarnaan-balik menghasilkan tampilan warna beragam dengan kualitas yang baik mendegradasi pewarna sintetik

Peran Laccase (Cont) Bioremediasi dan Biodegradasi Kesehatan Industrialisasi dan pertanian  senyawa karsinogenik dan mutagen Polimerisasi polutan  tidak larut, dipisahkan dengan adsorpsi, sedimentasi, atau filtrasi Kesehatan Katalis dalam pembuatan obat anti kanker Mengobati radang akibat tanaman beracun mengoksidasi iodida menjadi iodin (agen desinfeksi dan sterilisasi) Biosensor dan Diagnosis Mendeteksi oksigen, fenol, anilin, serta substrat tereduksi lain Menjadi label enzimatik dalam uji imunologi

Dapus Shraddha, Ravi Shekher, Simran Sehgal,Mohit Kamthania, and Ajay Kumar. Laccase:Microbial Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. 2011. Enzyme Research, Article ID 217861, pp 1-11 Madhavi, Vernekar. Laccase: Properties and Application. 2009. BioResources 4(4). Pp 1694-1717 Sunil S.More, Renuka P. S, Pruthvi K., SwethaM., S.Malini, and Veena S. M. Isolation, Purification, and Characterization of Fungal Laccase fromPleurotus sp. 2009. Enzyme Research. Article ID 248735, pp 1-7 Schroeder, M. et.al., Specificities of a chemically modified laccase from Trametes hirsuta on soluble and cellulose-bound substrates. Biotechnology Letters. 2006, Volume 28, Issue 10, pp 741-74 C, Galli.,et,all. How is the reactivity of laccase affected by single-point mutations? Engineering laccase for improved activity towards sterically demanding substrates. Appl Microbiol Biotechnol.2011. Epub 2011. p:123-31.

Terima Kasih