Pengujian Inhibisi hyaluronidase Kelompok 5 Chintya komalasari (G451130041) Dodi irwandi (G451130161) Era rahmi (G451130191) Shelly Rahmania (G851130351) Ummi zahra (G541130111) SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Enzim Hyaluronidase Hyalurodinase, enzim penghidrolisis suatu mukopolisakarida (Hyaluronate), suatu polisakarida terdiri dari unit berulang asam D-glukuronik dan N-asetil-D-glukosamin Penyebab beberapa penyakit diantaranya alergi yang disertai inflamasi. Ketika enzim berada dalam keadaan tidak aktif, keberadaan ion logam seperti kalsium secara in vivo berhubungan dengan degranulasi sel mast yang menyebabkan dihasilkannya mediator penyebab alergi dan inflamasi
Prinsip Pengujian + + Enzim Hyalurodinase Hidrolisis Ikatan (1-4) pada asam hyaluronase N-asetil- D- Glukosamin N-asetil- D- Glukosamin Alkali Intermediat Glukosazolin + Intermediat Glukosazolin p dimetilaminobenzaldehid (p-DMAB) Senyawa berwarna A 585 nm +
Peralatan dan Bahan Bahan Peralatan bufer asetat (0.1 M, pH 3.5) Sodium asetat (0.1 M) Asam asetat glasial (0.1 M) Enzim hyaluronidase Potassium hyaluronate kalsium klorida(2.5 mM) Sodium hidroksida (0.4 N) Potassium tetraborate 0.8 N, pH 9.1, (dengan penambahan KOH 5 M) p-Dimethylaminobenzaldehyde HCL 10N Air bebas ion Sampel Uji Screw cap test tubes (Pyrex) Mikropipet Water bath Timer UV/VIS spectrophotometer pH meter Pipet Volumetri Beakers Labu tentukur Measuring cylinders
DAFTAR KEBUTUHAN ALAT No Nama Alat Jumlah 1 UV/VIS spectrophotometer (kuvet) 2 pH meter 3 Water bath 4 Mikropipet 5 Timer 6 Screw cap test tubes (Pyrex) 20 7 Pipet volumetri 3 ml 8 Gelas Piala 100 ml 9 Gelas Piala 400 mL 10 Labu tentukur 25 mL 11 Labu tentukur 100 mL 12 Labu tentukur 1000 mL 13 Measuring cylinders
Daftar Kebutuhan Bahan/Reagen No Nama Bahan Kebutuhan 1 Bufer asetat (0.1 M, pH 3.5) 100 mL 2 Sodium asetat (0.1 M) 3 Asam asetat glasial (0.1 M) 150 mL 4 Enzim hyaluronidase 10 mg 5 Potassium hyaluronate 6 Kalsium klorida(2.5 mM) 100 mg 7 Sodium hidroksida (0.4 N) 25 mL 8 Potassium tetraborate 0.8 N, pH 9.1 9 KOH 5 M 10 p-Dimethylaminobenzaldehyde 11 HCL 10N 12 Air bebas ion 13 Sampel
TAHAPAN PENELITIAN Preparasi bufer dan larutan 1 Preparasi bufer dan larutan 2 Preparasi larutan enzim dan larutan substrat . 3 Aktivasi enzim Hyaluronidase 4 Inhibisi enzim Hyaluronidase teraktivasi Inhibisi enzim Hyaluronidase inaktif 5 6 Hitungan persentasi inhibisi
Pembuatan Larutan NaOH 0,4 N 1 Preparasi bufer dan larutan Pembuatan Larutan NaOH 0,4 N 1,6 gram NaOH 100 mL aquades
Preparasi bufer dan larutan 1 Preparasi bufer dan larutan Buffer asetat (0.1 M, pH 3.5) Larutan A Larutan B 1.155 mL as.asetat glasial 1.94 g CH3COONa Tera akuades Tera akuades Labu takar 100 mL Labu takar 100 mL 46.3 mL larutan B + 3.7 mL larutan A Tera akuades Labu takar 100 mL
p-dimetilaminobenzaldehida 1 Preparasi bufer dan larutan p-dimetilaminobenzaldehida 12.5 mL HCl (10 N) Tera dengan asam asetat glasial Labu takar 100 mL
p-dimetilaminobenzaldehida (p-DMAB) (67mM) 1 Preparasi bufer dan larutan p-dimetilaminobenzaldehida (p-DMAB) (67mM) Larutan p-DMAB yang digunakan Larutan stok P-DMAB 10 g Tera dengan asam asetat glasial 1 mL stok Tera dengan pelarut p-DMAB Labu takar 100 mL Labu takar 10 mL
Konsentrasi enzim (N.F.Unit/mL) 2 Preparasi larutan enzim dan larutan substrat . Larutan Enzim Enzim Buffer Konsentrasi (M) pH buffer Konsentrasi enzim (N.F.Unit/mL) Hyaluronidase Asetat 0.1 3.5 350 25 ml bufer asetat 17,5 mg enzim hyaluronidase Stok awal enzim = 500 u/mg Larutan enzim
Konsentrasi substrat (N.F.Unit/mL) 2 Preparasi larutan enzim dan larutan substrat . Larutan Substrat Substrat Buffer Konsentrasi (M) pH buffer Konsentrasi substrat (N.F.Unit/mL) Kalium Hyaluronat Asetat 0.1 3.5 1.2
Larutan enzim teraktivasi 3 Aktivasi enzim Hyaluronidase 400 µl enzim hyaluronidase (350 N.F units/ml bufer asetat) 100 µl larutan CaCl2 (2,5 mM bufer asetat) Inkubasi T=37oC , t=20 menit Larutan enzim teraktivasi
Inhibisi enzim Hyaluronidase teraktivasi 5 Inhibisi enzim Hyaluronidase teraktivasi Sistem Uji Blangko (µl) Kontrol (-) (µl) (+) (µl) Sampel Bahan uji - 100 DMSO Enzim teraktivasi 400 Bufer asetat Inkubasi; T = 37oC, t = 20 menit, dalam penangas air Kalium hyaluronat 500 NaOH 0,4 N Kalium tetraborat 0,8 N pH 9,1 Panaskan di dalam air mendidih, t = 3 menit. didinginkan dengan air p-DMAB 67 mM 3000 Inkubasi; T = 37oC, t = 20 menit, hingga terbentuk perubahan warna Diukur absorbansi pada 585 nm
Inhibisi enzim Hyaluronidase inaktif 5 Inhibisi enzim Hyaluronidase inaktif Bahan yang digunakan Blangko (µl) Kontrol (-) (µl) (+) (µl) Sampel Ket Enzim hyaloronidase (buffer asetat) 400 (Buffer) - 100 (sodium aurothiomalat) DMSO Inkubasi; T = 37oC, t = 20 menit, dalam penangas air CaCl2 Kalium hyaluronat 1,2 mg/mL (substrat) 500 NaOH 0,4 N Kalium tetraborat 0,8 N pH 9,1 Panaskan di dalam air mendidih selama 3 menit didinginkan dengan air p-DMAB 67 mM 3000 Diukur absorbansi pada 585 nm
Inhibisi dari enzim hyaluronidase yang tidak teraktivasi Tambahkan 400 µL larutan enzim hialoronidase Menambahkan 100 µL sampel diinkubasi pada 37oC selama 20 menit
Inhibisi dari enzim hyaluronidase yang tidak teraktivasi Tambahkan 500 µL Kalium hyaluronat (substrat) 1,2 mg/mL buffer asetat Tambahkan 100 µL CaCl2 (2,5 mM dalam buffer asetat (mengaktifkan enzim) diinkubasi pada 37oC selama 20 menit diinkubasi pada 37oC selama 20 menit
Absorbansi larutan tersebut diukur pada 585 nM Inhibisi dari enzim hyaluronidase yang tidak teraktivasi Reaksi enzim dihentikan dengan menambahkan 100 µL NaOH 0,4 N dan 100 µL Kalium tetraborat 0,8 N pH 9,1 Dipanaskan 3 menit kemudian tabung didinginkan di atas air dingin 3 mL larutan p-dmab 67 mM Absorbansi larutan tersebut diukur pada 585 nM
PERHITUNGAN Contoh perhitungan
Data absorbansi pada panjang gelombang 585 nm Form disiapkan 2, masing-masing untuk 1) Enzim yang diaktifasi 2) Aktivasi enzim yang tidak aktif Sampel Ulangan Konsentrasi (ppm) Absorban Blangko % Inhibisi IC50 (ppm) ICrata-rata (ppm) 1 200 100 50 25 12.5 2 3
Terima Kasih
400-1000 U/mg 500 u/mg Untuk 1 mg = 500 unit 350 u = 350/500 x 1 mg = 0,7 mg Untuk 25 ml buffer asetat = 0,7 x 25 mL = 17,5 mg