Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase Abdul Arifin 20508013

Klasifikasi DNA Ligase Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) Enzim Nomenklatur DNA Ligase (ATP) EC.6.5.1.1 Struktur molekul Definisi; DNA Ligase: salah satu enzim ligase yang membentuk ikatan kovalen fosfodiester diantara ujung 3’Hidroksi dari satu nukleotida dengan ujung 5’fosfat dari nukleotida yang lain dan melibatkan ATP dalam reaksinya. Sisi Aktif (Lysine) Mekanisme Reaksi Ligase ini, berasal dari virus Chorella, versi kecil dari yang ditemukan pada sel kita. Lysine 27 membentuk ikatan kovalen dengan phosphate dari AMP, membuatnya siap untuk reaksi ligasi Secara Umum; (DNA)n + (DNA)m (DNA)n+m DNA Ligase ATP AMP + Ppi

Mekanisme DNA Ligase Suatu rantai DNA yang terpisah NH-AMP DNA ligase ATP PP1 T4 E.coli NAD+ NMN Transfer gugus adenosil ke ujung 5’ fosfat pada DNA yang terpisah Gugus hidoksil menyerang ujung 5’ fosfat – adenosil - enzim DNA ligase NH2 AMP Ligated DNA Pembentukan intermediate enzim energi tinggi dengan transfer gugus adenosil dari NAD+ atau ATP pada gugus amino dari residu lysine

Tipe-tipe DNA Ligase Pada Hewan Mamalia terdapat 4 tipe spesifik dari enzim DNA Ligase, diantaranya ; DNA Ligase I : yang mengkatalis reaksi ligasi fragmen-fragmen Okazaki pada pemanjangan rantai sewaktu proses replikasi DNA berlangsung dan beberapa fragmen-fragmen rekombinasi DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang ditemukan pada sel yang tidak dapat membelah diri DNA Ligase III : Bentuk kompleks dengan XRCC1 suatu protein yang memperbaiki DNA dengan mencegah terjadinya mutasi penghilangan basa DNA dan fragmen-fragmen rekombinan DNA Ligase IV : Bentuk kompleks dengan XRCC4. Kompleks enzim ini mengkatalisis tahap akhir proses perbaikan penggabungan ujung non-homolog DNA rantai ganda. Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.

Regulator DNA Ligase Regulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun oleh Debbie Creissen dan Sydney Shall dalam Nature 296, 271-272 (18 March 1982) Nuclear ADP-ribosyl transferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribos dari NAD+ ke protein Kromatin untuk membentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi. Enzim ini sangat tergantung DNA untuk aktivitasnya dan diaktivasi dengan adanya celah dalam DNA. Hal ini mengindikasikan biosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkan untuk perbaikan yang efektif untuk beberapa jenis kerusakan DNA. Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol yang disusun oleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikan dalam Nucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19 7617-7631 Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhi reaksi ligasi pada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v) larutan PEG 6000, hanya ligasi intermolekular yang dipertinggi oleh kation-kation monovalent, sementara reaksi ligasi inter- dan intramolekular dapat terjadi tanpa PEG.  Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4) from Candida albicans Disusun oleh Andaluz, E., et. al., yang dipublikasikan dalam Yeast volume 15 issue 12, 1999, p1199-1210 menjelaskan tingkat transkripsi enzim CaLIG4 dalam C. albicans bervariasi selama siklus sel ragi. Sel-sel yang baru terbentuk mengandung tingkat transkripsi basa yang meningkat sampai tingkat maksimum ketika sel dalam keadaan G1 akhir. Sesudah itu, tingkat ranskripsi menurun ketika replikasi DNA dimulai.

Isolasi dan Karakterisasi DNA Ligase Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591 Denaturasi pisahkan gen DNA ligase menjadi DNA rantai tunggal dengan pemanasan 94oC selama 1 menit Annealing gabungkan primer ke rantai tunggal DNA, dengan suhu 50oC/140 detik Primer merupakan urutan daerah dari DNA ligase organisme x pembentukan rantai ke dua dengan DNA polymerase dan dNTP pada suhu 72oC selama 1,5 menit Extension Dilakukan PCR sampai 40 siklus, Fragmen yang dihasilkan (total panjang 600nt), yang mirip dengan gen DNA ligase organisme x

Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591 DNA Thermococcus sp. 1591 Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591 Primer 1 and 2 Membentuk gen utuh. Gen DNA ligase utuh

Karakterisasi DNA Ligase Aktivitas ligase dapat ditentukan melalui dua metode Salah satu sampel ditambahkan DNA ligase 1.Molekul DNA kontrol 2. DNA setelah penambahan enzim restriksi BstEII 3. Sama seperti 2, tetapi sebelum elektroforesis sampelnya dipanaskan 70oC selama 10 menit 4. Sampel fragmen DNA + BstEII dengan penambahan DNA ligase (45oC/1jam), buffer reaksi serta ATP 5. Mirip dengan 4 tetapi tanpa ATP C = produk ligasi (fragmen A + B) A dan B= fragmen hasil restriksi BstEII

Percobaan pertama DNA rekombinan Aplikasi DNA Ligase Percobaan pertama DNA rekombinan 1971 ilmuwan memanipulasi DNA dan menempatkannya ke dalam bakteri 1972 ilmuwan menggabungkan dua molekul DNA dari sumber berbeda menggunakan endonuclease EcoRI (untuk memotong) dan DNA ligase (untuk menggabungkan kembali)

Aplikasi DNA Ligase Kloning DNA pertama Boyer, Helling Cohen, dan Chang menggabungkan fragmen-fragmen DNA dalam sebuah vector, dan mentransfer ke sel E. coli Cohen and Chang menyimpulkan, mereka dapat menempatkan DNA bakteri ke dalam spesies bakteri yang berlainan Tahun 1980 Boyer and Cohen menerima paten untuk metode dasar transformasi dan kloning DNA

T DNA pembawa gen baru dalam kromosom tanaman Aplikasi DNA Ligase DNA ligase dimanfaatkan untuk menggabungkan secara kovalen ikatan fragmen-fragmen suatu DNA, secara luas kemampuan ini diaplikasikan ke penggabungan suatu fragmen DNA pada suatu vektor plasmid, hal ini merupakan teknik dasar rekombinasi DNA Organisma Modifikasi Genetik: Aplikasi DNA Ligase dalam Agriculture Agrobacterium DNA mengandung gen yang diinginkan Plant cell 1 2 3 Ti plasmid Regenerasi tanaman Rekombinan Ti plasmid Pemasukan gen ke dalam plasmid menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase pengenalan ke dalam sel tanaman yang dikembangkan T DNA T DNA pembawa gen baru dalam kromosom tanaman Tanaman hasil rekayasa Titik restriksi

Perkembangan Aplikasi DNA Ligase 1 Isolat DNA dari dua sumber Sel Manusia E. coli 2 Potong kedua DNA dengan enzim restriksi yang sama Plasmid DNA Gen V Sticky ends 3 campurkan DNA; mereka bergabung berdasarkan pasangan basanya Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119) Klon DNA : (teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik) 1. Potong DNA pada posisi tertentu dengan enzim restriksi endonuklease. 2. Gabungkan kedua fragmen DNA dengan DNA ligase. 3. Pilih molekul kecil yang mampu mereplikasi DNAnya sendiri. Potongan DNA dapat dimasukkan ke dalam kloning vektor (plasmid atau viral DNA) untuk membentuk DNA rekombinan. 4. Pindahkan DNA rekombinan dari tabung tes ke sell induk untuk replikasi. 5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan. 4 DNA ligase menggabungkan ikatan DNA secara kovalen Gen V Rekombinan DNA plasmid 5 plasmid dimasukkan ke bakteri 6 bakteri diklon Klon bakteri mengandung duplikat gen manusia

Tikus Rekayasa (Kanan), yang diekspresikan “Beras Keemasan” telah dimodifikasi secara genetik agar meengandung beta-karotene Beras ini dapat menolong mencegah terjadinya defisiensi terhadap vitamin A Kloning Sel-sel Hewan, Langkah menuju gen terapi Tanaman tembakakau, diekspresikan dengan gen firefly luciferase Tikus Rekayasa (Kanan), yang diekspresikan dengan gen HGH (Human Growth Hormone)

Sel-sel dan organisme rekombinan digunakan untuk menghasilkan protein-protein yang bermanfaat

Kesimpulan