Oleh: Hairunnisa – 20512007 Florence A. Husada – 20512057 Xylose Isomerase EC 5.3.1.5 Oleh: Hairunnisa – 20512007 Florence A. Husada – 20512057 Mata Kuliah KI-6161 Enzimologi November 2012

Agenda Presentasi Struktur & Mekanisme Reaksi Kinetika Enzim 1 Pendahuluan 2 Struktur & Mekanisme Reaksi 3 Kinetika Enzim 4 Isolasi & Pemurnian Enzim 5 Aplikasi di Industri 6 Modifikasi Genetika

2. Struktur & Mekanisme Reaksi 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Xylose Isomerase EC 5.3.1.5 EC 5 : Class Isomerase EC 5.3 : Subclass Intramolecular Oxidoreductases EC 5.3.1 : Subsubclass Interconverting Aldoses & Ketoses EC 5.3.1.5 : Xylose Isomerase Katalisis reaksi reversibel dalam isomerisasi D-xylosa menjadi D-xylulosa. D-glukosa menjadi D-fruktosa (beberapa enzim). Memiliki nama lain: D-xylose isomerase; D-xylose ketoisomerase; D-xylose ketol-isomerase; D-Glucose Isomerase Nama sistematik: D-xylose aldose-ketose-isomerase http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&view=INTENZ (11 November 2012 pukul 7.25 WIB) http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#0105 (11 November 2012 pukul 7.25 WIB)

Sejarah Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sejarah Xylose Isomerase Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa. 1957 – starting point; ditemukannya enzim pada Pseudomonas hydrophila dengan kemampuan mengisomerisasi glukosa oleh Marshall & Kooi. Ditemukan aktivitas xylose isomerase pada Escherichia intermedia . [Diketahui kemudian sebagai phosphoglucose isomerase (EC 5.3.1.9)]. Takasaki & Tanabe mengisolasi glucose isomerase (GI) (EC 5.3.1.18) dari Bacillus megaterium AI a yang terikat pada NAD dan spesifik terhadap glukosa.

Sejarah Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sejarah Xylose Isomerase Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa. Aktivitas GI yang sama diisolasi dari Paracolobacterium aerogenoides yang dapat mengkatalisis isomerisasi pada glukosa dan mannosa menjadi fruktosa. Dari sekian banyak yang ditemukan, Xylose Isomerase (EC 5.3.1.5) yang sangat cocok untuk dikomersialkan.

Sejarah Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sejarah Xylose Isomerase 1967 – Clinton Corn Processing Co., USA, pertama kali membuat isomerisasi glukosa enzimatik skala industri. 1980 – Kebutuhan high-fructose corn syrup (HFCS) dalam industri makanan meningkat, akhirnya seluruh perusahaan pengolah pati beralih menggunakan teknologi enzim.

Sumber Xylose Isomerase: Prokariot 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sumber Xylose Isomerase: Prokariot

Sumber Xylose Isomerase: Prokariot 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sumber Xylose Isomerase: Prokariot

Sifat Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sifat Xylose Isomerase Spesifisitas Substrat Mampu mengubah D-ribose, L-arabinose, L-rhamnose, D-allose, dan 2-deoxyglucose, seperti substrat yang biasanya digunakan, yaitu D-glucose dan D-xylose (afinitas tertinggi). Rasio konversi (D-glucose → D-fructose) = 26 – 59% (dari berbagai organisme). Nilai KM untuk D-glucose = 0.086 – 0.920 M Nilai KM untuk D-xylose = 0.005 – 0.093 M

Sifat Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sifat Xylose Isomerase Kofaktor dan Inhibitor Kofaktor: Mg2+, Co2+, Mn2+, atau gabungan dari ketiganya. Mg2+ dan Co2+ bertindak sebagai aktivator, Co2+ sebagai penstabil konformasi enzim. Inhibitor Logam: Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, Ca2+,dan Ni2+ Inhibitor Nonlogam: xylitol, arabitol, sorbitol, mannitol, lyxose, dan Tris.

Sifat Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Sifat Xylose Isomerase Suhu dan pH Optimum Range suhu optimum = 60 – 80°C (akan meningkat jika ada ion Co2+). Range pH optimum = 7,0 – 9,0. Studi Active-Site Melalui X-ray crystallography diketahui histidin dan gugus karboksilat ditemukan pada sisi aktif.

Kelebihan Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Kelebihan Xylose Isomerase Heat-stable Tidak membutuhkan kofaktor yang mahal, seperti NAD+ atau ATP. Meskipun afinitas enzim untuk glukosa 160x lebih kecil dibandingkan xylosa, tetapi enzim ini masih sangat menguntungkan secara komersial dibandingkan dengan isomerisasi secara kimia.

2. Struktur & Mekanisme Reaksi 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Chemical Conversion Enzimatic Conversion VS Membutuhkan suhu dan pH tinggi. Reaksi tidak spesifik dan cenderung membentuk produk samping yang tidak diinginkan. Sulit memperoleh [fruktosa] > 40%. Rasa fruktosa tidak enak dan kurang manis. Dapat bekerja pada pH dan suhu lingkungan. Reaksi spesifik. Tidak menghasilkan produk samping. Rasa fruktosa lebih manis.

Struktur Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Struktur Xylose Isomerase Berat Molekul bervariasi, antara 52,000 to 191,000 Da. Subunit struktur = trimer, tetramer, dimer, atau subunit yang identik (terikat secara non-kovalen).

2. Struktur & Mekanisme Reaksi 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Mekanisme Reaksi Interconversion of xylose to xylulose serves a nutritional requirement in saprophytic bacteria that thrive on decaying plant material and also aids in the bioconversion of hemicellulose to ethanol. Isomerization of glucose to fructose is of commercial importance in the production of high-fructose corn syrup (HFCS). Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996

Kinetika Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Kinetika Xylose Isomerase Dilakukan pengamatan terhadap pembentukan D- fruktosa sebagai fungsi waktu inkubasi dengan konsentrasi D-glukosa awal. Data mengindikasi afinitas D- glukosa terhadap enzim lebih rendah daripada D-xylosa. D-glukosa (KM=0,5 M pada pH 8,0 dan 40°C). D-xylosa (KM=3x10-3 M pada pH 7,5 dan 30°C). Suhu optimum ditentukan pada konsentrasi D-glukosa 0,2 M = 42 – 43°C. The final concentra-tions of the components of the incubation mixtures were as follows: arsenate buffer (pH 8.0), 0.05M; MgC12, 0.01M; washed lyophilized cells of Pseudomonas hydro-phila (N.R.C. 492), 10 mg/ml; and D-glu-cose as indicated. Final volume was 2.0 ml, and the incubation temperature was 40?C. The reaction was stopped by with-drawing 0.25-ml aliquots into 4.75 ml of 0.5M HC104. After centrifugation and suitable dilution, fructose was estimated by a modification (9) of the cysteine-car-bazole test. All values were corrected for the color contributed by D-glucose. The color contributed by the enzyme prepara-tion was negligible. Sumber: Marshall, R. O. and Kooi, R. E., 1957

Isolasi Xylose Isomerase dari Streptomyces 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Isolasi Xylose Isomerase dari Streptomyces Sampel tanah dari ladang jagung dikumpulkan Diinokulasi pada medium agar berisi salt starch solid dan liquid setelah serial dilution. Kemudian, dilakukan Gram Staining, uji oxidase, uji hidrolisis pati, gelatin, dan kasein, & uji H2S. Produksi dan Ekstraksi Enzim Media produksi yang digunakan: Xylosa (0,75%), Peptone (1,00%), Yeast Extract (0,5%), dan MgSO4.7H2O (0.1%). pH dijaga agar tetap di atas 7,0. Setelah media steril, kultur diinokulasi, inkubasi 24 jam. Setelah diproduksi 2,00 mL pindahkan ke 100 mL lalu inkubasi lagi. Begitu seterusnya hingga volume 1000 mL. Sel dipanen dan dicuci dengan akuades, disuspensikan kemudian dipecah selnya menggunakan homogenizer. Debris dipisah agar enzim dapat dimurnikan. Gram positive, violet color, filamentous rod shaped bacteria were examined under microscope. Hasil tes positif semua Sumber: Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010)

Pemurnian Xylose Isomerase 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Pemurnian Xylose Isomerase Pemurnian dapat dilakukan menggunakan metode Heat treatment, Precipitation menggunakan garam amonium sulfat-aseton-Mg2+ atau Mn 2+, Kromatografi penukar ion, Gel filtrasi, dan Kromatografi afinitas.

2. Struktur & Mekanisme Reaksi 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Aplikasi di Industri Produksi Bioetanol Interconversion dari xylosa menjadi xylulosa menyediakan nutrisi yang dibutuhkan bakteri saprofitik untuk melakukan pembusukan material tanaman dan biokonversi hemiselulosa menjadi bioetanol. Sumber: http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (11 November 2012 pukul 22.30 WIB)

2. Struktur & Mekanisme Reaksi 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Aplikasi di Industri Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS) HFCS (glucose:fructose = 1:1) 1.3 kali lebih dari sukrosa dan 1.7 kali lebih manis dari glukosa. Harga HFCS 10 to 20% lebih rendah dari pemanis sukrosa dan tidak akan mengalami penggumpalan seperti sukrosa. Baik digunakan untuk penderita diabetes karena direabsobsi secara perlahan oleh perut dan tidak berpengaruh pada kadar glukosa dalam darah. Biasa digunakan pada beverage, baking, canning, dan confectionery industries.

2. Struktur & Mekanisme Reaksi 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Aplikasi di Industri Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS) Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996

Modifikasi Genetik untuk Meningkatkan Produksi Enzim 1. Pendahuluan 2. Struktur & Mekanisme Reaksi 3. Kinetika Enzim 4. Isolasi & Pemurnian Enzim 5. Aplikasi di Industri 6. Modifikasi Genetika Modifikasi Genetik untuk Meningkatkan Produksi Enzim Dicapai dengan melakukan strain improvement melalui mutagenesis atau teknologi DNA rekombinan. Hasil dari beberapa modifikasi genetik: Peningkatan jumlah enzim sebesar 60% melalui mutagenesis Streptomyces wedmorensis dengan ethyleneimine dan N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine. UV irradiation terhadap Streptomyces olivochromogenes menghasilkan strain mutan dengan peningkatan aktivitas 70%. Mutan yang dimutagenesis dengan ethyl methanesulfonate menghasilkan1,500 U/mL enzim ketika ditumbuhkan pada media berisi glukosa saja, sementara parent memproduksi 10 U/mL dengan kondisi yang sama. Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996

Daftar Pustaka Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., (1996), Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase, Microbiolology and Molecular Biology Review, 60(2):280, p. 280 – 300. Marshall, R. O. and Kooi, R. E., (1957), Enzymatic Conversion of D-Glucose to D-Fructose, Science, Vol. 125, No. 3249 (Apr. 5, 1957), p. 648 – 649. Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010), Isolation, Purification & Characterization of Glucose Isomerase Enzyme form Streptomyces species isolated from Parbhani Region, Journal of Enzyme Research, ISSN: 0976–7657 & E-ISSN: 0976–7665, Vol. 1, Issue 1, p. 01 - 10. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#01 05 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB) http://www.brenda- enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=5.3.1.5 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB) http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&vie w=INTENZ (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB) http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (diakses pada 11 November 2012 pukul 22.30 WIB)

Thank You..