Large Scale Production and Commercialization of Proteins from Recombinant Microorganisms Linawati Hardjito, PhD

Biology Engineering Chemistry Statistics Genetics Economics Process & Products Development Natural Products Pharmaceuticals Biomedical probes Nutraceuticals Cosmetics Food/Feed Industrial Chemicals Biotechnology Biodiversity Pollution Control Bioremediation Biofiltration Bioleaching Bioabsorption Aquaculture related product

Bioprocess Engineering

Bioreactor 2000 L

Bioproses proses yang memanfaatkan organisme (khususnya mikroorganisme) untuk mengasilkan produk & proses yang bermanfaat untuk kemidupan manusia dan lingkungannya Sub-disiplin bioteknologi yang berperan merubah penemuan bioteknologi menjadi produk/proses Contoh: Produksi rekombinan enzim amilase dengan Saccharomyces cerevisiae dan Pichia pastoris Produksi rekombinan selulase, lipase dengan Escherichia coli Produksi penisilin dengan Penicillium sp Bioremeidasi tanah terkontaminasi minyak bumi Produksi biopigmen pycoerythrin dengan mikroalga Porphyrodium cruentum

Biology Engineering Chemistry Statistics Genetics Economics Process & Products Development Natural Products Pharmaceuticals Biomedical probes Nutraceuticals Cosmetics Food/Feed Industrial Chemicals Biotechnology Marine Biodiversity Pollution Control Bioremediation Biofiltration Bioleaching Bioabsorption Aquaculture related product

Pengembangan budidaya Perbaikan genetik Mutasi Rekayasa genetika Oganisme/ekstrak terpilih Fraksinasi Pemurnian Karakterisasi Struktur elucidasi Pengembangan & Optimasi bioproses Pemilihan media (C,N, mineral,dll) Pemilihan kondisi lingungan fisik & kimia (t,pH,salinas,cahaya,oksigen) Pengembangan budidaya Down stream processing Pemanenan pemurnian Formulasi produk Proses terpilih product

Bioprocess engineering is the discipline Basic research Molecular biology High value added product Bioprocess Engineering Bioprocess engineering is the discipline that puts biotechnology to work

Sifat Unggul Bioprocess Kondisi reaksi yang ringan/ramah lingkungan Temperatur & tekanan ruang Reaksi bersifat sangat spesifik dan efektif Enzim/mikroorganisme mengkatalisis reaksi tertentu Reaksi yang kompleks dapat diupayakan menjadi satu kesatuan Beberapa enzim/mikroorganisme bekerja bersama-sama Menggunakan sumberdaya terbarukan Penerapan rekayasa genetika menungkinan untuk meningkatan produktiftas

Sifat lemah bioproses Campuran produk yang kompleks : mikroba, produk, sisa nutrien Mudah terjadi kontaminasi Perlu sterilisasi dan penjagaan kondisi aseptik Variabilitas dan ketidakstabilan Mutasi alami Mikroorganisme (enzim) tidak bisa bekerja pada kondisi yang sangat bervariatif

Produk bioproses Berdasarkan volume produksi dan nilai jual Volume besar nilai rendah Volume besar nilai menengah Volume kecil nilai tinggi Berdasarkan letak produk Intraselular Ekstraselular Berdasarkan peran dalam metabolisme Metabolit primer Metabolit sekunder Berdasarkan waktu produksi Growth associated Non-growth associated

Konsentrasi sel (g/L, OD600nm, jumlah sel/mL) Waktu (jam,hari) sel Growth associated (metabolit primer Non Growth associated (metabolit sekunder)

Kebutuhan pengembangan bioproses mikroorganisme nutrien ( sumber karbon, nitrogen, mineral, vitamin, oksigen, dll) Makronutrien Mikronutrien Kondisi lingkungan yang sesuai (pH, salinitas, temperatur, tekanan) Bioreaktor (tempat kultivasi )

Penggolongan bioproses Berdasarkan kebutuhan oksigen Aerobik & anaerobik Berdasarkan kandungan air dalam campuran substrat : padat & cair Berdasarkan moda operasi : batch, fed-batch, continuous Berdasarkan letak pertumbuhan sel : tersuspensi & tertambat

Bioreaktor dan moda operasi bioreaktor : bejana, tabung, reaktor yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme Jenis bioreaktor & metode kultivasi Batch (curah) : tidak ada penambahan nutrien dan pemanenan produk atau pembuangan limbah selama proses kecuali udara (oksigen) untuk proses aerobik Fed-batch (curah umpan) : ada penambahan nutrien selama proses tapi tidak ada pemanenan sampai /pembuangan limbah selesai Continuous (sinambung) : ada penambahan nutrien dan pemanenan /pembuangan limbah selama proses

Bioreaktor

Batch proses

F = kecepatan penambahan nutrien (medium) (ml/jam, L/jam) Fin =0 Fout =0 F = kecepatan penambahan nutrien (medium) (ml/jam, L/jam) In = masuk, out =keluar Fin= Fout = 0

Keuntungan Sederhana Relatif murah dibandingkan proses lainnya Proses cepat Kelemahan Produk inhibisi Substrat inhibisi

Fed-batch (curah umpan) Sel & substrat Sel (X) Fin = F ml/jam Fout =0 Substrat (S) Vt waktu Vo

Keuntungan Produksi sel pada konsentrasi yang tinggi (high cell density) Mengurangi substrat inhibisi Kelemahan Produk inhibisi

Continuous (sinambung) Sel & substrat Fin = F ml/jam Fout =F Sel (X) Produk (P) Substrat (S) Vt =vo waktu

Keuntungan Mengurangi inhibisi produk Mengurangi inhibisi substrat Sistem pada kondisi steady state : bagus untuk menentukan parameter kinetik Kelemahan Waktu operasi lama Kemungkinan kontaminasi kompleks

Monitoring pertumbuhan dan pembentukan produk Pertumbuhan sel Berat kering (g/L, mg/mL) Kekeruhan ( optical density) : spektrofotometer Jumlah sel (hemositometer & mikroskop) Sisa substrat (nutrisi) : g/L, mg/mL Pembentukan produk : g/L, unit/mL Kondisi lingkungan : pH, T, salinitas, Dissolved Oxygen

Kinetika Pertumbuhan dan pembentukan produk Specific growth rate (µ): perrcepatan pertumbuhan µ mengikuti persamaan Monod atau Michaelis Menten Untuk proses batch (curah) Nutrisi tersedia berlebih (diberikan pada saat awal proses) Nilai Ks kecil µ mendekati µ max

Yield (Y) Yx/s : sel yang dihasilkan per substrat yang dikonsumsi (g sel/ g substrat), Δx/ Δs Yp/s : produk yang dihasilkan per substrat yang dikonsumsi (g produk/ g substrat), Δp/Δs =Yp/x : produk yang dihasilkan per sel yang tersedia (g produk/ g sel), Δp/ ΔX

Kinetika pada proses batch

Ln Xt µ Ln Xo T =waktu

Sumber karbon laktat (3g/L) Contoh penentuan µ Waktu kultivasi (jam) Sumber karbon laktat (1 g/L) Sumber karbon laktat (3g/L) Konsentrasi sel (g/L) 0.049 0.042 2 0.106 0.197 4 0.305 0.279 6 0.62 0.628 8 1.14 1.032 10 1.23 1.398 12 1.248 1.722

Kinetika pada proses continuous (sinambung) F= feed rate (kecepatan umpan, ml/Jam, l/jam V= volume bioreaktor (ml, L, m3) F/V = D : dilutaion rate, nilai konstan D= µ X: Sel (g/L) T ; waktu kultivasi (jam, hari) S: Substrat (g/L) P : produk (g/L)

Pada kondisi steady state Sel & substrat Sel (X) dx/dt= 0 Substrat (S) ds/dt=0 waktu

Pada kondisi steady state Sel & substrat dx/dt= 0 Sel (X) Substrat (S)

Pada kondisi steady state Sel & substrat Sel (X) dx/dt= 0 Substrat (S)

Sel & substrat Sel (X) Produk (P) Substrat (S) waktu

Produktifitas bioreaktor sinambung Sel (X) = X. D (g/L.jam) Sisa substrat (S) = S.D (g/L.jam) Produk (P) = P.D (g/L.jam)

Penentuan nilai Ks D (1/jam) µmax ½ µmax Ks S (g/L)

Contoh kasus Suatu bioproses yang memanfaatkan mikroalga (Chlorella sp) digunakan untuk mengolah limbah industri pupuk yang mengnadung ammonium 200 mg/L dengan volume limbah yang dihasilkan adalah 75 m3/jam. Peraturan pemerintah mengharuskan kadar ammonium dalam air buangan maksimum 5 mg/L. Bila dari hasil percobaan di laboraorium diperoleh data kinetika sebagai berikut : Yx/s =0.1 g sel/g NH4+ dan µmax = 0.5/hari Tentukan : Berapa ukuran kolam (biorekator) yang harus dibuat supaya tidak terjadi kematian mikroalga (wash out) Berapa konsentrasi mikroalga yang dihasilkan dalam bioreaktor Berapa produktifitas mikroalga yang diperoleh Bila mikroalga mengnadung vitamin B1 dengan kadar 0.1 ug/gram sel, berapa produktifitas vitamin B1 yang dihasilkan

Berikut adalah data hasil percobaan di laboratorium untuk pertumbuhan mikroalga Chlorella sp. Waktu (hari) Kepadatan sel Sel/mL 1 2.5 x 105 2 3.5 x 105 3 7.5 x 105 4 2.15 x 106 5 4.90 x 106 6 5.90 x 106 7 6.05 x 106 8 5.55 x 106 Bila mikroalga tersebut akan digunakan untuk mengolah air dari kolam budidaya yang mengandung kadar ammonium 15 mg/L. Bila air tersebut akan diresirkulasi ke kolam dengan persyaratan bahwa kadar ammonium tidak boleh lebih dari 0.1 mg/L dengan kolam pengolah air yang tersedia memilki kapasitas 1000 m3. 1.Tentukan berapa flow rate yang diperbolehkan agar air yang dihasilkan dari unit pengolah memenuhi persyaratan yang diinginkan 2. Hasil percobaan laboratorium menunjukkan bahwa dari 1 gram ammonium dihasilkan 0.3 g biomasa 3. Berapa maksimum specific growth rate yang dimiliki mikroalga ?

Komersialisasi Demand oriented Technologically feasible Economically feasible Investment, Payback Period, IRR, B/C Social and environmentally feasible