MARKER BIOKIMIA

Deteksi dengan menggunakan marker Deteksi tidak langsung (gene products): isozymes, allozymes Deteksi langsung (DNA sequence): Biochemical marker Allozyme Non-PCR based marker RFLP, Minisatellite (VNTR) PCR based marker Microsatellite, RAPD, AFLP, CAPS (PCR-RFLP), ISSR, SSCP, SCAR, SNP, etc. Traditional marker systems PCR generation: in vitro DNA amplification RFLPs SSRs RAPDs AFLPs ISSRs SNPs others

Isozymes and Allozymes Lactate Dehydrogenase Dym et al 2000: PNAS 97:9413–9418 Mutasi menyebabkan perbedaan pada komposisi asam dan basa asam amino, tetapi tidak menyebabkan perubahan fungsi enzim Perubahan kecil pada struktur primer dapat mengubah struktur sekunder Isozim adalah enzim-enzim yang memiliki molekul aktif dan struktur kimia yang berbeda tetapi mengkatalis reaksi kimia yang sama.

Teknik : Elektroforesis dan pewarnaan enzim Isozim/Allozim (marker biokimia) Bentuk alternatif dari protein tertentu yang divisualisasi pada gel sebagai band dengan mobilitas yang berbeda. Polymorphism karena adanya mutasi sebuah asam amino diganti, muatan elektrik protein mungkin berubah Teknik : Elektroforesis dan pewarnaan enzim

Allozyme diversity …Met-Leu-Ala… …Arg-Leu-Ala… DNA …ATG-CTA-GCT… Protein …AGG-CTA-GCC… …Arg-Leu-Ala… Silent Replacement mutations

Isozim adalah bentuk yang bermacam-macam dari enzim tertentu. Allozymes: Allelic isozymes: bentuk berbeda dari sebuah enzim yang dikode pada lokus yang sama Isozim dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan elektroforesis dan pewarnaan tertentu

Konsep dari isozim adalah sebagai berikut: Bentuk molekular enzim yang lebih dari satu (isozim) adalah umum terdapat pada organisme. 2. Isozim berbagi aktivitas katalitik umum. Tiap isozim memiliki tugas spesifik dalam lintasan metabolik dan berfungsi dengan harmonis dengan enzim lain dalam organisasi sel. 3. Isozim sering menunjukkan sel atau jaringan yang khusus. 4. Heterogenitas molekular dari isozim confers flexibility, versatility and precision upon an organism in terms of metabolic functions.

Persiapan sampel Transportasi dan penyimpanan sampel Penanganan sampel merupakan bagian penting dari metode untuk mendapatkan ekstrak enzim yang baik. Koleksi biji harus tetap disimpan dingin dan kering selama di perjalanan, tetapi biji relatif toleran terhadap fluktuasi suhu. Jika disimpan, sebaiknya disimpan di refrigerator atau dibekukan. Sampel daun sebaiknya tetap dingin, lembab dan teraerasi. Keadaan basah dan anaerobic menyebabkan tumbuhnya jamur dan kematian sampel. Sampel daun sebaiknya disimpan di refrigerator dan tidak dibekukan.

Ekstraksi enzim harus dilakukan segera setelah sampel daun tiba di lab Ekstraksi enzim harus dilakukan segera setelah sampel daun tiba di lab. Perkecualian untuk pine bud dapat disimpan di -80C dalam waktu lama atau disimpan dalam liquid nitrogen.

EKSTRAKSI FOLIAGE and Pine buds: ANGIOSPERM FOLIAGE: 0.2M phosphate buffer pH 7.5 0.3% bovine albumin 0.1% dithiothreitol 2.0% sodium ascorbate 10.0% PVP-40 0.1% 2-mercaptoethanol (optional) ANGIOSPERM FOLIAGE: Same as conifer foliage, but: increase PVP-40 to 12%

Sampel daun: Digerus/dihancurkan X mg sampel daun dengan 2X ul buffer ekstraksi hingga menjadi serbuk dalam liquid nitrogen. Jangan dibiarkan sampai mencair. Simpan microtube pada -80 sampai siap digunakan. Pada hari elektroforesis dilakukan, cairkan dan sentrifuge tabung. Letakkan dalam es sampai sampel dimasukkan di gel.

Detection Dipisahkan melalui elektroforesis pada gel pati atau pada gel poliakrilamida Isozim dideteksi berdasarkan aktivitas enzim Pewarna mengandung substrat untuk enzim, kofaktor, dan oxidized salt (dye) Pola-pola yang teramati disebut zymogram Hillis, D.M., C. Moritz and B. K. Mable. 1996. Molecular Systematics, 2nd ed.  Sinauer Assoc. Inc., Sunderland, Mass

Persiapan Gel Elektroforesis Introduction: Teknik gel yang berbeda : agarosa, poliacrylamide dan pati dapat digunakan untuk elektroforesis isozim. Gel dibuffer secara kimia ke dalam pH spesifik dan menjadi matriks yang dilalui oleh enzim bermigrasi sebagai respon terhadap arus listrik. Gel pati banyak digunakan untuk studi isozim. Gel pati mudah dipotong sehingga pewarnaan dapat dilakukan untuk bermacam-macam enzim dalam satu kali runnung elektroforesis.

Sebelum elektroforesis proteins adalah molekul terpolarisasi

Setelah elektroforesis

Malate Dehydrogenase (MDH1) sunflower gel Isozyme Raw Data PI 599761 PI 599761 PI 599761 A PI 240660 allelle 1 C B D E invariant mito. band allelle 2 l-102 B-4 MDH gel by M. Brothers Malate Dehydrogenase (MDH1) sunflower gel

Aplikasi Hubungan kekerabatan/hubungan genetik dalam dan antar populasi, sering berhubungan dengan struktur geografik. Keragaman genetik pada spesies tanaman klon Forestry and agriculture Conservation biology Seed bank populations (Cabin 1998, McCue 1998) Perubahan lingkungan dan heterogenitas habitat (Lehman 1997) Patologi tumbuhan (Leuchtman 1996) Koleksi plasma nutfah (Lamboy 1996)

Miroslav Zeidler 2000. ACTA UNIVERSITATIS PALACKIANAE OLOMUCENSIS FACULTAS RERUM NATURALIUM BIOLOGICA 38: 1-10