KROMATOGRAFI

Adalah suatu teknik pemisahan atas dasar perbedaan sifat fisik dan kimiawi dari zat penyusun suatu campuran Adanya tendensi molekul suatu zat untuk : - larut dalam suatu cairan - teradsorpsi pd butir zat padat yg halus dg permukaan yg luas - masuk ke fase uap atau menguap

JENIS KROMATOGRAFI Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi kolom : Kromatografi adsorbsi Kromatografi partisi cair-cair Kromatografi pertukaran ion Kromatografi filtrasi gel Kromatografi Gas Cairan

POLARITAS Adanya pemisahan kutub muatan positif dan negatif dr suatu molekul sbg akibat terbentuknya konfigurasi tertentu dr atom-atom penyusunnya. Dg dmkn molekul tsb dpt tertarik oleh molekul yg lain yg jg mempunyai polaritas. Tingkat pemisahan dr muatan tsb menentukan derajat polaritasnya, dmkn jg daya tariknya.

Sifat polaritas, khususnya digunakan sbg petunjuk sifat zat pelarut, adsorben dan senyawa-senyawa yg dipisahkan (solute). Air termasuk zat pelarut & mempunyai polaritas terbsr krn konfigurasi elektron dan geometri molekulnya dpt menghasilkan dipol permanen yang sangat kuat.

ADSORBEN & PELARUT Dpt bersifat polar atau non polar Adsorben polar = silika & alumina, dpt mengadsorp solut yg bersifat polar. Adsorben non polar = arang (charcoal)

POLARITAS RELATIF BERBAGAI ZAT PELARUT Konstanta dielektrik Nama zat Pelarut 1,890 2,023 2,238 2,284 4,806 4,340 6,020 20,700 24,300 33,620 80,370 Petroleum eter, heksan, heptan Sikloheksan Karbon tetraklorida, Trikloroetilen, Toluen Benzen, diklorometan, Kloroform Etil eter Etil asetat Asdeton, n-propanol Etanol Metanol Air

ADSORBSI & PARTISI Keduanya dipengaruhi oleh perbedaan polaritas solute yang dipisahkan Polaritas mrpkn faktor yg menentukan daya larut dan terjadinya adsorbsi solute

KROMATOGRAFI ADSORBSI NO KROMATOGRAFI ADSORBSI KROMATOGRAFI PARTISI 1 Sangat peka thd bntk stereometrik suatu senyawa. Sangat trgantung pd daya larut (BM) senyawa dlm suatu pelarut. 2 Adsorben mempunyai polaritas konstan & pelarut dpt diatur polaritasnya sesuai kebutuhan Kedua fasenya lbh sulit u/ diatur polaritasnya. 3 U/pemisahan dlm kuantitas lbh besar Baik u/pemisahan solut yg sangat serupa sifatnya, bersft kualitatif. 4 U/ pemisahan senyawa kurang polar (hidrokarbon) U/ pemisahan senyawa yang lebih polar (karbohidrat & protein)

ADSORBEN Silika gel Alumina bersifat asam dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat asam digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT). Alumina bersifat basa dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat basa. digunakan untuk kromatografi kolom

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ( K L T )

Mrpkn kromatografi adsorbsi dan adsorben bertindak sbg fase stasioner. Dapat digunakan untuk memisahkan : ion-ion organik komplek senyawa organik dg anorganik senyawa organik alami dan sintetis Pemisahan lebih sempurna, kepekaan tinggi dan dpt dilakukan dg cepat

Gambar KLT

ADSORBEN Silika gel ( asam silikat ) Alumina ( aluminum oxyde ) Kieselguhr (diatomeous earth) Selulosa

SILIKA GEL Silika Gel G Silika Gel H Silika Gel PF mengandung 13% Kalsium Sulfat sebagai zat perekat biasanya mengandung ion logam (besi) dihilangkan dg pelarut metanol : asam HCl pekat = 9 : 1 Silika Gel H digunakan untuk pemisahan yang spesifik, terutama lipida netral. dpt memisahkan berbagai digliserida spt 1,2 digliserida dari 1,3 digliserida; fosfatidil gliserol dari poligliserida fosfat. Silika Gel PF senyawa organik yg terikat dpt berfluoresensi.

ALUMINA Mampu memisahkan bermacam senyawa terpen, alkaloid, steroid,alisiklik, alifatik dan aromatik Tidak mengandung zat perekat Sifat sedikit alkalis Dapat digunakan dengan ataupun tanpa aktivasi

KIESELGUHR untuk pemisahan senyawa polar.

PEMBUATAN PLAT Untuk KLT Mikro Untuk KLT Makro Mis. Silika gel G = 35 gram adsorben dilarutkan dalam 100 ml zat pelarut kloroform-metanol (2:1 v/v). Plat kaca dicelupkan dalam larutan tsb. Diuapkan selama 5-10 mnt u/ mencegah retak pd lapisan adsorben atau terjadinya case hardening. Untuk KLT Makro Suspensi adsorben silika gel H dicampur dg air = 30 g / 60-70 ml air Plat berukuran 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, dan 20 x 20 cm. Keuntungannya : adsorben dapat melekat lebih baik, dpt dibuat lebih tebal u/ kepentingan tertentu, dapat dilaksanakan pada tempat yg lebih luas Kerugiannya : pembuatan lebih sukar & perlu aktivasi plat dg pemanasan 110oC selama 1 jam.

Cara pembuatan plat yg besar : plat kaca dicuci dg detergen, dibilas dg aquades & dikeringkan. Suspensi adsorben yg telah dibuat dilapiskan pd permukaan plat kaca menggunakan aplikator (Stahl Desaga). Tebal lapisan antara 250 mm – 2mm Plat yg sudah terlapis sebelum di aktifkan harus didiamkan dulu pada suhu kamar selama + 30 menit.

MENETESKAN SAMPEL Gunakan luas plat sesuai kebutuhan Buat garis dg jarak 8 – 10 mm (u/ plat mikro) dan 1,5 – 2,0 cm (u/ plat makro) dar dasar plat. Sampel dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguap (ttk didihnya 50 – 100oC) Larutan sampel diteteskan pada plat menggunakan pipet mikro atau syringe dan dibiarkan mengering sebelum tetesan berikutnya dikerjakan. Jumlah sampel yang diteteskan dpt berkisar antara 5-100mg dari larutan 0,1 % Pengeringan tetesan sampel menggunakan gas N2 untuk mencegah terjadinya kerusakan sampel karena oksidasi.

PENGEMBANGAN Menggunakan wadah tertutup yg berisi senyawa pelarut. Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi sampel dalam sistem pelarut. Pemilihan sistem pelarut atas dasar like dissolves like, misalnya untuk memisahkan lipida digunakan sistem pelarut heksan : eter : asam asetat = 80 : 20 : 1 Pengembangan di akhiri bila ujung zat pelarut pada plat telah mencapai + ¾ tinggi adsorben (15 – 16 cm) Pengeringan plat dg aliran gas N2

METODE PENGEMBANGAN Pengembangan satu dimensi Pengembangan dua dimensi Berjalan 1 arah dg 1 macam sistem pelarut Pengembangan dua dimensi Dikerjakan 2 arah Sampel di teteskan di pojok kanan bawah ( 2 cm dari kanan & bawah) untuk plat 20 x 20 cm Setelah pengembangan I selesai, plat dikeringkan dg gas N2 Setelah kering, plat dikembangkan lagi dg menggunakan sistem pelarut yang ke II dg memeutar plat 90o.

Pengembangan ganda Dikerjakan searah (1 dimensi) dan dilaksanakan beberapa tahap (umumnya 2 tahap) Sistem pelarut yg digunakan berbeda Masing-masing tahap pengembangan di akhiri dg pengeringan sblm dilakukan pengembangan berikutnya. Mis. Pemisahan lipida netral dan lipida polar . Pengembang I = kloroform : metanol : aquades = 60 : 25 : 4, dihentikan setelah permukaan pelarut mencapai 10 cm. Setelah pengeringan, dikembangkan lagi dg sistem pelarut Heksan : Eter = 4 : 1.

VISUALISASI DAN IDENTIFIKASI Untuk melihat komponen penyusun yg sudah terpisah setelah proses pengembangan Bersifat destruktif dan non destruktif destruktif akan merusak sampel secara irreversible (u/ pengukuran kuanti & kualitatif) nondestruktif baik u/KLT preparatif & pengukuran kuantitatif Bersifat umum dan spesifik Identifikasi membandingkan posisi spot dg senyawa standar visualisasi khusus (mis. Dg ninhidrin, senyawa yg mengandung gugus amino akan menunjukkan spot kuning jingga)

Uap iodium Sinar UV Charring Spot akan berwarna coklat dg dasar putih Tidak merusak komponen yg telah terpisah Dpt digunakan u/semua senyawa organik yg tidak jenuh (dg ikatan rangkap) Sinar UV memberikan fluoresensi pd plat yg mengandung unsur fosfor sifatnya non destruktif Charring penyemprotan plat dg lar H2SO4/K2Cr2O7 kmdn dipanaskan pd suhu 125oC Zat organik akan mengalami oksidasi menjadi karbon yang berwarna hitam

Reagensia umum (terbatas u/ senyawa organik yg non volatil) H2SO4 pekat senyawa organik akan mjd spot hitam H2SO4 - Na2Cr2O7 H2SO4 - K2Cr2O7 H2SO4 – HNO3 HClO4 Iodium senyawa organik akan mjd spot coklat

Reagen Spesifik Untuk mendeteksi secara kualitatif & mengenal adanya gugus tertentu dalam senyawa yg dipisahkan. Reagensia ini bersifat destruktif

Anilin pthalat Spot yg terdiri dari gula-gula reduksi akan memberikan berbagai warna Anisaldehid dlm H2SO4 dan HOAc Senyawa ini untuk menunjukkan adanya karbohidrat. Karbohidrat menunjukkan warna biru Antimon triklorida dalam CHCl3 Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid, steroid glikosida,lipida alifatik,dan vit A. Zat tsb dg UV akan menunjukkan berbagai warna tertentu Bromokresol jambon Untuk pengenalan ion-ion halogen kec. F & asam dikarboksilat Senyawa tsb akan menunjukkan warna kunin atau jingga

2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH) Bromokresol hijau Pengenal asam karboksilat Senyawa tersebut akan memberikan warna kuning/jingga 2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH) Pengenal aldehid dan keton yg akan membentuk warna kuning sampai kemerahan. Reagensia Dragendorf Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik (mberikan warna orange) Feri Klorida Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.

8-Hidroksiquinolin-NH3 Fluorescein-Br2 Pengenal senyawa organik tidak jenuh ( Dg UV akan menunjukkan warna tertentu) 8-Hidroksiquinolin-NH3 Pengenal kation anorganik (dg UV akan terlihat berbagai warna) Ninhidrin Gugus amino akan berwarna biru.

Profil KLT fraksi aktif ekstrak daun pecut kuda (S. jamaicensis) Fase gerak : CHCi3 : MeOH : EtOAc (9:3:5) ; Fase diam = Silika Gel F254; H fraksi heksan, C fraksi kloroform, E fraksi etil

Reagen fosfomolibdat u/ deteksi senyawa terpenoid dan warna yg dihasilkan adlh hijau kebiruan. Reagen H2SO4 u/ deteksi senyawa terpenoid yg akn mnghslkn warna spot coklat, hijau, kuning, merah atau biru. Pd perlakuan H2SO4 50% kmdn dipanaskan suhu 100-110oC selama 5 mnt,mnghslkn spot coklat

JENIS KLT A. KLT Preparatif Tebal adsorben 1 – 1,5 mm (makin tebal, pemisahannya makin sulit) Pengeringan adsorben harus optimal u/mencegah case hardening dan retak. 2 ml sampel (50-250 mg) diaplikasikan dg cara menggariskan setebal 5-8 mm pada garis dasar (tidak smp merusak adsorben) Cara visualisasi yg dipakai dg non destruktif, terutama dg UV, penyemprotan dg air atau uap iodium. Komponen terpisah dikerok, diletakkan dlm corong dg kertas filter Diekstrak dg pelarut yang polaritasnya sesuai.

B. KLT Kuantitatif, dilakukan pendekatan dg : Analisa langsung pada plat, dengan : Charring secara standar, kmd digunakan densitometer untuk menentukan kuantitasnya Pengukuran radioaktivitasnya, khususnya senyawa yg ditandai dg radioaktif Dengan neutron activation analysis Gravimetri : masing2 komponen diisolasi, diekstrak, diuapkan dan ditimbang. Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus fungsional dengan spektrofotometer.

C. KLT dengan argentasi U/ pemisahan senyawa yang mempunyai jumlah ikatan rangkap yang berbeda & isomer cis dan trans dr asam lemak. Plat adsorben mengandung AgNO3 : Mencelup plat KLT ke dalam larutan AgNO3 10-12%,atau Menambahkan larutan AgNO3 dlm pembuatan larutan adsorben Sistem pelarut campuran heksan eter dg proporsi yg bervariasi tergantung jumlah ketidak jenuhan senyawanya u/ memisahkan monoenoat (ik. Rangkap 1) = 93 : 7 u/ dienoat (ik. Rangkap 2) = 83 : 17 u/ monoena, diena, triena, tetraena, pentaena, heksaena dari metil esternya = 60 : 40.

SELESAI . . .

Komponen lipida polar kacang tanah yg dipisahkan dg TLC dua dimensi I. Kloroform : Metanol : 28% amonia = 65 : 25 : 5 (v/v) II. Kloroform : Aceton : Metanol : HAc : Air = 3 : 4 : 1 : 1 : 0,5 (v/v) X1, X2, X3, X4, tidak diketahui; PE = Fosfatidil etanolamin, PI = Fosfatidil Inositol, PS = Fosfatidil Serin, LPE = Lisofosfatidil Etanolamin, LPC = Lisofosfatidil Kolin dan PA = Asam fosfatidat

Contoh hasil pengembangan ganda