Analisa mtDNA dengan Metode DHPLC Agung Marssada Ingrid C.E.I Monika Wijaya Nirwanto Honsono Teknik Bioproses UI

Manfaat Untuk Uji forensik dimana sampel DNA yang dimiliki jumlahnya tidak banyak dan tidak reproducible Untuk penyelidikan kriminal ataupun genetika forensik

Definisi mtDNA  Adalah DNA manusia yang ada di mitokondria. Bersifat haploid dengan sedikit perbedaan pada basa nitrogen dan panjang molekul yang relatif identik tiap mt DNA Implikasi  Sulit dianalsia

Metode yang lazim untuk uji DNA nukleus  elektroforesis Metode yang lazim untuk uji DNA nukleus  elektroforesis. Sayangnya metode ini sulit diterapkan pada mt DNA. Hal ini akibat perbedaan yang sedikit sehingga mudah terjadi overlapping

Metode-metode lain Denaturing Gradien Gel Electrphoresis (DGGE) Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) Sayangnya metode-metode ini membutuhkan lebih banyak waktu dan penelitiannya lebih rumit serta sangat mahal

Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) Cepat, murah, dan murah Tidak membutuhkan manipulasi DNA yang berlebihan Prinsip kerja  memisahkan campuran DNA untuk dibuat rangkaiannya. Tujuan  Untuk mengetahui tingkat kecocokan dari dua buah sampel DNA

Kelebihan DHPLC Sensitivitas DHLPC sangat tinggi  mendeteksi hingga setiap sequence yang berbeda ( substitusi, insersi, delesi,dll) Bisa mendeteksi suatu campuran yang kompleks Bisa mengukur dan memurnikan produk PCR Mendeteksi hingga 95 – 100% mutasi pada DNA.

Gambaran Ringkas metode Dua macam Mt DNA didenaturasi Campuran akan dikromatografi dengan pelarut cair tertentu Didalam kolom kromatografi, DNA yang cocok akan membentuk heteroduplet Heterodulpet akan keluar duluan, setelah itu dianalisa jenisnya.

Prosedur dan Cara Kerja DHPLC

1. Heat denaturated Campuran dari dua atau lebih DNA dipanaskan sampai terdenaturasi. Dimasukkan dalam kolom DHPLC akan membentuk homo & heteroduplices Homoduplices  menggambarkan komponen asli dari campuran Heteroduplices  cross-hybridization dari beberapa kontributor yang berbeda ke campuran.

2. Pemisahan homo dan heteroduplices Saat kondisinya setengah denaturing dilarutkan ke dalam pelarut nonpolar ( ACETONITRILIE). Heteroduplices  kurang stabil  ada 1 atau lebih pasangan basa yang tidak cocok, sehinga muncul sebagai early eluting peak pada grafik kromatografi.

3. Isolasi Isolasi heteroduplices, kemudian baru diidentifikasi dengan menggunakan pembaca rangkaian DNA.

Staionery Phase dalam DHPLC PCR enzym Pelarut non polar (asetonitril)

4. Analisa Detail Analisa dilakukan dengan DNA analyzer untuk melihat kecocokan pasangan basanya Dapat juga dengan melihat yield heterodupleks untuk analisa semi-kualitatif persen kecocokan

Apa yang dianalisa? Kecocokan DNA dari dua buah sampel berdasarkan pasangan basa nitrogennya

Why must MtDNA? HPDLC adalah metode analisa DNA berdasarkan kesamaan pasangan basa, jadi tidak butuh fragmen besar, Mt DNA fragmennya kecil

Flowchart

Aplikasi

1. Human subjects Sampel yang mau diuji: Kain yang digunakan manusia Darah Air liur Semen Rambut dengan akar (0,5 cm)

Menaruh 10 mikroliter darah ke kapas steril yang sudah terlebih dahulu direndam ke dalam air murni (nanopure water) Dibiarkan di udara hingga kering selama 2 jam pada suhu ruangan. Simpan pada suhu -200 C.

2. Ekstraksi, Purifikasi, dan Amplifikasi mtDNA Diekstraksi menggunakan EZ1 DNA Tissue kit run on the BioRobot® EZ1 with DNA Forensic Card (Qiagen Inc., Valencia, CA) Setelah diekstraksi, masukkan ke dalam 200μL of TE (10mM Tris, 1mM EDTA), kemudian dideteksi dengan qRT-PCR, rantai dari hasil residu yang akan menginterferensi hasil disingkirkan dngan sentrifugasi dan dimasukkan ke dalam tabung baru.

Didalam kolom DHPLC, sampel akan diamplifikasi dengan PCR serta diretensi oleh asetonitril Sampel Dianalisa

Kalau sampelnya potongan kain? Sampel yang berupa potongan kain, kapas, atau karpet, dimasukkan ke dalam 190μL of the Qiagen’s proprietary “G2 Buffer” dan 10μL of proteinase K solution (600mAU/mL) Vortex (diputar) selama 10 detik dan diinkubasi dengan suhu 56oC selama 15 menit. Pindahkan larutan ke tabung 2 mL baru dimasukkan ke dalam BioRobot® EZ1.

Didalam kolom DHPLC, sampel akan diamplifikasi dengan PCR serta diretensi oleh asetonitril

Pertanyaan-Pertanyaan Aditya Rinus: Definisi heteroduplices dan Tujuan analisis? Khotib Sarbini: Kenapa harus menganalisa mtDNA? Apa itu mitokondria Kenny Lischer: - Apakah bisa menganalisa mt DNA dengan teknik RHPLC?

Republik Daudy: Apa fase gerak yang dipakai pada analisa DHPLC mtDNA? Sampel DNA haploid atau diploid Nindya Sani: Analisa DNA selain sampel darah bisakah? Pak Setiadi: Bisakah menguji DNA selain manusia? Apakah masih perlu menggunakan elektroforesis?