Reaksi Transglukosidik Enzim β-glukosidase Famili-3 Aspergillus niger : Analisis Kualitatif dan Kuantitatif serta Bukti bahwa Reaksi Transglukosidik Tidak Terpengaruh pH KI6161 Enzimology Tunjung Mahatmanto (20506004) Muhtar Kosim (20506009) Sumber : Transglucosidic Reactions of The Aspergillus niger Family 3 -glucosidase: Qualitative and Quantitative Analyses and Evidence that The Transglucosidic Rate is Independent of pH Heather F. Seidle, Reuben E. Huber. Archives of Biochemistry and Biophysics 436 (2005) 254–264

Pendahuluan Selulosa Selulase Transglukosilasi Tujuan Penelitian Polisakarida utama tumbuhan. Senyawa organik paling melimpah. Merupakan polimer lurus dari 1,4-β-D-glukosa. Selulase Mempunyai 3 macam aktifitas: 1. Menghidrolisis dari dalam (endoglukanase, E.C. 3.2.1.4). 2. Memutus ujung-ujung rantai selulosa (selobiohidrolase, E.C. 3.2.1.91). 3. Menghidrolisis selobiosa dan oligosakarida lain menjadi glukosa (β-glukosidase, E.C. 3.2.1.21). β-glukosidase memegang peranan kunci pada tahap akhir degradasi selulosa menjadi glukosa dan juga menghilangkan efek inhibisi selobiosa terhadap komponen selulase lain. Transglukosilasi Terjadi jika akseptor (alkohol atau gula) menggantikan air pada tahap akhir reaksi degradasi selulosa. Tujuan Penelitian Untuk mempelajari reaksi transglukosidik β-glukosidase (Family 3 A. niger) dengan penekanan pada pengaruh pH.

HIDROLISIS SELULOSA Selulase menghidrolisis ikatan (1-4) glikosidik. Hidrolisis ini dapat mendegradasi selulosa menjadi gula yang lebih sederhana, yaitu glukosa yang siap memasuki jalur metabolisme untuk menghasilkan energi. Selulase bekerja dengan konsep (C1-Cx). Ekso (1-4) glukanase (faktor C1) menghidrolisis selulosa kristalin. Endo (1-4) glukanase (faktor Cx) menghidrolisis selulosa amorf. (1-4) glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa.

Mekanisme Reaksi Ikatan glikosidik antara gula non-pereduksi dan bagian substrat yang lain (–OR) putus. Sisi yang ditinggalkan oleh –OR menjadi sisi akseptor. Akseptor (substrat kedua) akan terikat pada sisi akseptor dan ikatan kovalen terbentuk antara akseptor dan glukosa yang terikat secara kovalen pada enzim. Akseptor berkompetisi dengan air dan tingkat reaksi transglukosidik bergantung pada affinitas dan konsentrasi dari akseptor, dan juga kecenderungan dari akseptor untuk bereaksi. reaksi hidrolitik. reaksi yang terjadi pada akseptor ketika substrat menjadi akseptor. menunjukkan kompleks dengan enzim. Tanda garis menunjukkan ikatan kovalen. E: β-glukosidase; Glc-OR: substrat; Glc: D-glukosa; Glc-Glc-OR: adduct transglukosidik Ks: konstanta disosiasi substrat; Ki”: konstanta disosiasi substrat dari sisi akseptor; k2: laju tahap glikolitik; \ k3: laju tahap hidrolitik; k4: laju tahap transglukosidik.

Prosedur Eksperimen Purifikasi Untuk mendapatkan enzim β-glukosidase (Family 3 A. niger) murni. Separasi dan NMR dari produk reaksi transglukosidik Untuk mengetahui bahwa struktur adduct transglukosidik memang sesuai dengan yang diperkirakan. Analisis laju awal Untuk menentukan laju awal pembentukan aglikon (v0 aglikon) dan intermediet transglukosidik (v0 trans). Analisis TLC dan GLC Untuk mengetahui reaksi apa yang menjadi sebab terjadinya kinetika (dilihat dari produk yang dihasilkan).

Hasil Analisis Kinetik Plot Michaelis-Menten antara v0 aglikon terhadap konsentrasi pNPGlc pada berbagai pH Pada konsentrasi substrat rendah, laju reaksi meningkat untuk semua pH. Pada konsentrasi substrat tinggi, laju reaksi akan turun untuk pH dibawah 6 namun tetap naik untuk pH diatas 6. Tiap kurva garis dalam gambar di samping didapat dari regresi non-linier:

lanjutan Harga Vmax(h) untuk ketiga substrat ([ ]: selobiosa; [ ]: oNPGlc; [ ]: pNPGlc) menghasilkan kurva berbentuk bel. Harga Vmax(t) untuk ketiga substrat relatif konstan (3, 12, 5 µmol/min/mg berturut-turut untuk substrat pNPGlc, selobiosa, oNPGlc). Vmax(h) dan Vmax(t) berpotongan pada pH ~ 5,5. Harga Km(h) turun seiring dengan kenaikan pH. Harga Km(t) (tidak ditunjukkan) untuk tiap substrat turun ~ 2 kali lipat antara pH 3-4 namun kemudian kembali konstan. Harga Vmax(h)/Km(h) meningkat sampai pH 4,5 kemudian tetap konstan.

Hasil Analisis Reaksi Data TLC dan GLC menunjukkan bahwa: Pada konsentrasi substrat rendah hanya terjadi reaksi hidrolisis. Reaksi transglukosidik terjadi ketika konsentrasi substrat cukup tinggi sehingga substrat akan terikat dan bereaksi sebagai akseptor. Analisis NMR untuk reaksi pNPGlc (pH 4,5) menunjukkan bahwa 6-O-β-D-glukopiranosil-β-D-glukopiranosil-p-nitrofenol dan gentiobiosa merupakan adduct transglukosidik yang terbentuk. Sedangkan dua intermediet untuk reaksi selobiosa (pH 4,5) adalah 6-O-β-D-glukopiranosil-4-O-β-D-glukopiranosil-D-glukopiranosa dan gentiobiosa.

lanjutan Progress reaksi dengan selobiosa yang diikuti menggunakan GLC A. Konsentrasi selobiosa 5 mM pada pH 4,5 (kiri) dan 7 (kanan) B. Konsentrasi selobiosa 50 mM pada pH 4,5 (kiri) dan 7 (kanan) ([ ]: glukosa; [ ]: trisakarida; [ ]: gentiobiosa) Analisis GLC pada konsentrasi selobiosa 5 mM menunjukkan intermediet (trisakarida dan gentiobiosa) yang dihasilkan rendah. Sebaliknya, pada konsentrasi selobiosa 50 mM intermediet yang dihasilkan tinggi.

lanjutan Laju awal pembentukan glukosa sesuai dengan apa yang diharapkan. Garis kurva didapat dari regresi non-linier: Laju awal pembentukan trisakarida meningkat setelah lag yang singkat. Garis putus-putus kurva didapat dari regresi non-linier: Laju awal pembentukan glukosa dan trisakarida pada berbagai konsentrasi selobiosa

Diskusi Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa konstanta laju reaksi transglukosidik (k4) dari β-glukosidase (Family 3 A. niger) independen terhadap pH antara pH 3-7 sementara konstanta laju reaksi hidrolisis (k3) turun. Karena Vmax(h) mengandung harga k3 sementara Vmax(t) tidak, maka penurunan laju reaksi hidrolisis (seperti tampak pada kurva di samping) pasti adalah karena penurunan harga k3.

lanjutan Hal lain yang mendukung penyimpulan di atas adalah harga Vmax(h)/Km(h) konstan pada pH diatas 4,5 sementara Vmax(h) turun. Jika diasumsikan bahwa k-1 » k2, maka harga Vmax(h)/Km(h) akan = k2[Et]/Ks. Apabila Vmax(h)/Km(h) konstan pada pH diatas 4,5, dapat diasumsikan pula bahwa k2 dan Ks juga konstan pada pH 4,5-7 dan penurunan harga Vmax(h) pasti terjadi karena penurunan k3. Alasan yang sama mengikuti untuk penurunan harga Km(h).

lanjutan Reaksi hidrolisis (k3) dan reaksi transglukosidik (k4) diprediksikan mempunyai mekanisme yang sama. Alasan mengapa harga k3 turun dan k4 tetap konstan masih tidak jelas. Hal ini diduga terjadi karena: Suatu basa pada sisi aktif mungkin menghilangkan proton dari air atau hidroksil akseptor untuk mengkatalisis reaksi. Perubahan konformasi yang bergantung pada pH dapat terjadi dengan air sementara kemampuan pengikatan yang lebih dari hidroksil akseptor lebih besar dapat mencegah perubahan konformasi. Glikosidase mengandung gugus-gugus (utamanya Tyr) yang mendonasi proton untuk pemutusan ikatan kovalen dengan gula non-pereduksi dan penurunan harga k3 dapat terjadi karena gugus kehilangan protonnya.

lanjutan Harga k2, k3 dan k4 tidak diketahui, tetapi karena data menunjukkan dalam kebanyakan kasus (kecuali pada pH tinggi) k3 lebih besar dari k4, maka harga Ki” akan lebih kecil dari Km(t). Namun, harga Km(t) dari pNPGlc, oNPGlc dan selobiosa (tidak ditunjukkan) konstan pada pH ≥ 4,5. Karena k3 turun dan k4 konstan pada pH > 4,5 maka satu-satunya kemungkinan untuk harga Km(t) konstan terhadap pH adalah jika harga k3 dan k4 sama-sama kecil dibandingkan dengan k2 dan karena itu Km(t) ~ Ki”.

lanjutan Transient transglukosidik terbentuk pada konsentrasi substrat yang tinggi karena substrat akan terikat pada sisi +1 dan +2 yang kosong sebelum glukosa pada sisi -1 dilepaskan. Substrat yang terikat pada sisi akseptor kemudian bereaksi (k4) dengan glukosa membentuk produk transglukosidik. Pada konsentrasi substrat rendah, hanya reaksi hidrolisis yang terjadi dan karena itu, seperti diperkirakan dalam persamaan (1), yang tampak adalah kinetika hiperbola normal. Pada konsentrasi substrat tinggi, substrat juga menjadi akseptor dan terikat pada sisi akseptor. Glc: akseptor; G: glukosa; G-G: selobiosa; G~G-G: 6-O-β-D-glukopiranosil-4-O- β-D-glukopiranosil-D-glukopiranosa; G~G: gentiobiosa.

lanjutan Efek reaksi hidrolisis dan transglukosidik pada konsentrasi substrat rendah dan tinggi ini adalah karena substrat akan terikat pada sisi akseptor dengan affinitas yang lebih rendah dibandingkan dengan pada sisi substrat. Bukti kuat bahwa kinetika adalah hasil dari reaksi transglukosidik yang terjadi pada konsentrasi substrat tinggi dapat dilihat dari kurva di samping, yaitu ketepatan data v0 trans terhadap garis kurva yang didapat dari regresi non-linier:

lanjutan Progress reaksi dengan selobiosa yang diikuti menggunakan GLC pada pH 7 A. Konsentrasi selobiosa 5 mM B. Konsentrasi selobiosa 50 mM ([ ]: glukosa; [ ]: trisakarida; [ ]: gentiobiosa) Penemuan bahwa kebanyakan reaksi pada pH 7 adalah transglukosidik (seperti tampak di atas) dapat dimanfaatkan untuk menghasilkan produk transglukosidik yang bernilai-guna tinggi untuk industri makanan dan farmasi.

lanjutan Nukleofilisitas dari hidroksil primer C6 ditambah dengan potensi aksesnya yang lebih besar daripada hidroksil sekunder yang terhalangi secara sterik pada posisi glukosa lainnya merupakan faktor yang berpengaruh besar. Yan et al. melaporkan bahwa β-glukosidase lain (dari A. niger) mengkatalisis reaksi transglukosidik pada substrat selobiosa untuk menghasilkan selotriosa. Enzim tersebut pasti memposisikan glukosa untuk bereaksi dengan hidroksil C4. β-glukosidase (dari Trichoderma reseei) membentuk sophorose, karena itu, ia harus memposisikan akseptor Glc sehingga hanya ikatan dengan posisi C2 yang terbentuk. Data di atas menunjukkan spesifisitas interaksi substrat dengan akseptor. Dari hasil analisis NMR diketahui bahwa desain sisi akseptor spesifik memposisikan hidroksil C6 untuk aksi akseptor. Hidroksil C2 harus ekuatorial. Pembentukan gentiobiosa terjadi secara intermolekul karena subsisi +1 mempunyai affinitas rendah terhadap akseptor.

lanjutan Masih belum jelas mengapa sebagian aktivitas enzim ini adalah transglukosidik. Adalah mungkin bahwa aktivitas ini diperlukan untuk membentuk transient inducer bagi sistem selulase A. niger. Dalam hal ini, gentiobiosa atau trisakarida mungkin merupakan inducer. Mungkin juga aktivitas transglukosidik berfungsi untuk memproduksi oligosakarida kecil sebagai cadangan glukosa. Oligosakarida transglukosidik mungkin juga menjadi titik awal produksi selulosa de novo.