Pengenalan laboratorium, alat & media II

Lab. Kultur jaringan Kegiatan kultur jaringan di dalam laboratorium: Persiapan media dan bahan tanaman. Isolasi dan penanaman. Inkubasi dan penyinaran kultur

Ruangan Ruang persiapan & ruang stok Ruang isolasi & penanaman Ruang kultur Ruang mikroskop atau ruang analisa

Peralatan Timbangan Analitik Autoclave Peralatan gelas dan labu takar

Entkas LAF Centrifuge Shaker Hot Plate Stirer Mikroskop

MEDIA TANAM MEDIA TANAM Fungsi Menyediakan air Menyediakan kebutuhan hara mineral Menyediakan vitamin Menyediakan zat pengatur tumbuh Membuang sisa metabolisme tanaman

Komposisi Air Garam mineral Sumber karbon Vitamin Senyawa organik komplek Zat pengatur tumbuh Buffer Bahan pemadat Arang aktif

Aquabides (air destilata ganda) Air distilata Aquabides (air destilata ganda) Garam Mineral 1. Hara Makro Nitrogen : NO3-, NH4+ (25-60 mM) Kalium : KCl or K2HPO4 20 -30 mM Fosfor : K2HPO4 or KH2PO4 1-3 mM Kalsium : CaCl2 or Ca(NO3)2 1-3 mM Magnesium : MgSO4 1-3 mM Sulfur : SO4 1-3 mM

2. Hara Mikro Besi (Fe) : 1 m M Mangan (Mn) : 5-30 m M Seng Boron (B) Tembaga :0.1 m M Molybdenum : 1 m M Cobalt (Co) : 0.1 m M

Fungsi Unsur-Unsur Anorganik Hara makro: K berperan dalam sintesa protein, penggerak bbrp enzim, membuka & menutupnya stomata Ca: penyusun struktur dinding sel, cofactor enzim, permeabilitas sel, komponen dari kalmodulin. P: penyusun ATP, asam nukleat, coenzim dan fosfolipid. Mg: penyusun molekul klorofil, membantu aktifitas enzim. Mn: mengatur oksidasi auksin, aktifator enzim S: penyusun bbrp asam amino, protein, coenzim A

Hara Mikro: Fe berperan dalam sintesa klorofil, cytokrom. Cl berperan dalam proses osmosis dan kesetimbangan ion. Cuberperan dalam cofactor enzim. Zn berperan menahan oksidasi auksin, berguna dalam sintesa triptofan dan sebagai aktifator enzim. Bo berperan mempengaruhi penggunaan Ca Co diperlukan oleh orgnisme dlm memfiksasi N2. I berperan dalam transport auksin.

Sumber Karbon Jenis : sukrosa glukosa, maltosa, dan rafinosa Fruktosa dan galaktosa Konsentrasi optimum sukrosa tergantung dari jenis jaringan yang dikultur. Pada kultur kalus dan pucuk, 2-4 %. kultur embrio, mencapai 12 %. Fungsi Gula : sumber energi sebagai penyeimbang tekanan osmotik media

Vitamin, Asam Amino dan Senyawa N Organik thiamine (vitamin B1 esensial dalam kultur jaringan tanaman nicotinic acid (niacin)  media kultur akar tomat, ercis dan lobak pyridoxine (vitamin B kultur akar tomat Myo-inositol / meso-inositol / i-inositol  memperbaiki pertumbuhan & morfogenesis Pantothenic acid pertumbuhan jaringan tanaman tertentu, seperti Salix sp Vitamin E (tocopherol)

Asam amino dan senyawa N organik L-methionine arginine, urea, glutamine, asparagin dan amonik

Zat Pengatur Tumbuh diperlukan untuk mengendalikan dan mengatur pertumbuhan kultur tanaman mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, dan organ

Auksin untuk merangsang kalus, suspensi sel dan organ. Pemilihan jenis dan konsentrasi, tergantung dari : Tipe pertumbuhan yang dikehendaki. Level auksin endogen. Kemampuan jaringan mensintesa auksin. Golongan zat tumbuh lain yang ditambahkan.

Sitokinin sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. untuk menstimulus pembelahan sel dan merangsang pertumbuhan tunas pucuk Fungsi sitokinin antara lain adalah: Memacu terbentuknya organogenesis dan morfogenesis. Memacu terjadinya pembelahan sel. Kombinasi antara auxin dan sitokinin akan memacu pertumbuhan kalus.

Giberilin Diferensiasi atau perbanyakan fungsi sel, terutama pembentukan kalus Pengaruh positif giberelin: dalam kultur bit gula GA3 merangsang pembentukan pucuk dari potongan inflorescence Pertumbuhan kultur pucuk kentang juga baik bila 0.10-0.10 mg/l GA3 dikombinasikan dengan 0.5-5.0 mg/l kinetin Fungsi geberelin antara lain adalah: Mematahkan dormansi Memacu perkecambahan. Memacu terjadinya proses imbibisi.

Bahan Pemadat AGAR Keuntungan dari pemakain agar adalah : Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperature 100o C,  kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman. Tidak bereaksi dgn persenyawaan-persenyawaan penyusun media.

Kekentalan media dipengaruhi : Merek agar yang digunakan, merek agar yang berbeda, memberikan kekentalan yang sedikit berbeda walaupun beratnya sama. pH media. Penambahan arang aktif. Arang aktif 0.8-1 g/l menghambat pembekuan agar

Gelrite Sifat-sifat Gelnya lebih jernih Untuk memadatkan media dibutuhkan lebih sedikit (1,5 -3 g/l) kekerasan gel dr gelrite sangat dipengaruhi adanya garam-garam : NaCl, KCl, MgCl2.6H2O & CaCl2 Garam NaCl dan KCl menurunkan kekerasan gel MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekerasan gel 3) Lebih murni dan konsisten dalam kualitas. Gelrite : cenderung menaikkan kelembaban nisbi (RH) dalam kultur verifikasi

Arang Aktif atau Charcoal adalah arang yang sudah dipanaskan selama beberapa jam dengan menggunakan uap atau udara panas sifat adsorpsi yang sangat kuat Arang aktif dapat ditambahkan ke dalam media pada berbagai tahap perkembangan kultur ( media inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran). Penambahan arang aktif dapat membantu pertumbuhan perkembangan kultur, tergantung dari jenis kulturnya Arang aktif ditambahkan dengan konsentrasi yang bervariasi yakni 0.5-6 %

Fungsi Arang Aktif sbb: Mengadsorpsi persenyawaan-persenyawaan toxic yang terdapat dalam media yang dapat menghambat pertumbuhan kultur, seperti : Persenyawaan-persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka waktu inisiasi. Persenyawaan 5-hidroksimetil furfural yang diduga terbentuk dari gula yang berada dalam larutan asam lemah dan mengalami pemanasan dengan tekanan tinggi

Mengadsorpsi zat pengatur tumbuh sehingga: Mencegah pertumbuhan kalus yang tidak diinginkan, seperti dalam androgenesis dan pucuk yang ingin diakarkan. Membantu embryogenesis kultur dalam media regenerasi tanpa auksin, mungkin dengan bertindak sebagai sink yang menarik auksin dari dalam sel sehingga embryogenesis dapat terjadi Merangsang perakaran dengan mengurangi tingkat cahaya yang sampai ke bagian eksplan yang terdapat dalam media

Buffer (Chelating Agen) Penambahan asam amino seringkali juga bersifat sebagai buffer organik. Fe SO4 dan Na-EDTA Penambahan KH2PO4 sendiri tidak efektif sebagai buffer.

Senyawa Organik Komplek Alamiah Air Kelapa Bahan-bahan yang terkandung dalam air kelapa, a l: as amino, as organik, as nukleat, purin, gula, gula alkohol, vit, mineral, dan ZPT 2. Juice Tomat & Ekstrak Pisang Banyak digunakan untuk kultur embrio anggrek. Sumber gula, vitamin, ZPT, dan asam amino.

3. Casein Hydrolysate Dalam kultur jagung, penambahan ekstrak ragi 800 mg/l atau casein hydrolysate 200 mg/l memperbaiki pertumbuhan kalus, Penambahan casein hydrolysate dalam media regenerasi padi, meningkatkan jumlah pucuk yang terbentuk dalam kalus padi.

4. Ekstrak ragi 5. Ekstrak kentang Ekstrak ragi menyumbangkan asam amino, peptida, vitamin, untuk pertumbuhan kultur. Konsentrasi yang digunakan dalam kultur berkisar antara 0.5 - 2 gram/l. 5. Ekstrak kentang Digunakan dalam kultur anther padi  meningkatkan pertumbuhan kalus dan regenerasi anther Ekstrak kentang biasanya digunakan setara 10-30 % dengan hasil terbaik 20 %. Sumber gula, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan asam amino.

Faktor Lingkungan pH Media Pengaturan pH selain memperhati’ kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor : Kelarutan dari garam-garam penyusun media Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain Efisiensi pembekuan agar. Sel-sel tanaman membutuhkan pH yg sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8

Kelembaban Cahaya Temperatur RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan Cahaya  Intensitas chy yg rendah dpt mempertinggi embriogenesis dan organogenesis.  Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan p’bentukan tunas dr kalus tembakau pd intesitas yg rendah.  Pembentukan kalus maksimum sering terjadi pada tempat yang lebih gelap Temperatur Pertumbuhan yang optimum : 200-300C. Pertumbuhan kalus endosperm : 250C.

Media Dasar Media dasar Murhasige dan Skoog (MS), untuk hampir semua jenis kultur, terutama tan. herbaceous. B5, untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain. White, sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat. Vacin dan Went , untuk kultur jaringan anggrek. Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel. schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM) Media N6 untuk serealia terutama padi.

Penghitungan Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per liter. 1 molar (M) = massa molekul dalam g/l. 1 mM = massa molekul dalam mg/l 10-3 M. 1 µM = massa molekul dalam µg/l 10-6 M atau 10-3 mM.

Konversi dari mg/l ke mili molar (mM) Konversi dari mili molar (mM) ke mg/l contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0. 1 M larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l. 1 mM larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l 1 µM larutan 2,4 D berisi 0,000221 g/l = 0,221 mg/l Konversi dari mg/l ke mili molar (mM) Massa molekul CaCl2. 2H2O = 40.08 + 2 x 35..453 + 4 x 1.008 + 2 x 16 = 147.018 Jadi 440 mg/l CaCl2. 2H2O = 2.99 mM.

Pembuatan Media V1M1 = V2M2 membuat stok Stok makro stok mikro, stok Fe, stok vitamin stok hormone 2-4 minggu pengenceran 4-8 minggu V1 = vol lar stok yg dicari M1 = konsentrasi lar stok V2 = vol medium yg akan dibuat M2 = konsentrasi yg akan dibuat V1M1 = V2M2

Skema pembuatan media Makro nutrien Stok Fe Mio-inositol Stok mikro nutrien 300 ml Sukrosa Stok Vit Stok ZPT + aquades  950 ml Ukur pH 5,7-5,8 + aquades  1000 ml Skema pembuatan media Masukkan agar, masak  larut Tuang dlm botol kultur Tutup dgn kapas & alm unium foil, STERILISASI