Metode Transfer Gen Dalam Sel Mamalia Win Darmanto, Ph.D.

Metode tranfeksi DNA virus dengan cara Calcium Phosphate coprecipitation. Ekstrak DNA virus dicampur dengan buffer phosphate dan ditambah calcium chloride, sehingga membentuk presipitat DNA-calsium phosphate. Selanjutnya diinfeksikan ke dalam kultur sel.

Selanjutnya diinfeksikan ke dalam kultur sel monolayer, beberapa jam untuk memberi kesempatan sel kultur selama beberapa sel akan mengambil DNA virus. Selanjutnya precipitate dipisahkan dari sel dan dikulture dengan medium baru, untuk menhasilkan virus baru yang sama sifatnya dengan asalnya.

Metode tranfeksi DNA virus dengan cara Calcium Phosphate coprecipitation.

Selectable marker yang digunakan pada sel mamalia untuk medeteksi tranfer gen melalui mekanisme cotransformasi

Transfer gen nonselectable dengan cotranfeksi gen marker Transfer gen nonselectable dengan cotranfeksi gen marker. Fragment DVA virus Herpes simplek membawa gen tk telah dicampur dengan gen β-globin. Ke dua gen tersebut dimasukkan dalam kultur sel kelinci mutant tk- dan ditambahkan calsium phosphate.

Calsium phsphate dihilangkan dan ditambah HAT medium (sebgai medium selektor thd gen tk) hanya sel yang mengandung gen tk+ saja yang bisa hidup. Berikutnya yang tumbuh gen tk saja. Koloni ditumbuhkan dan DNA di potong dg enzym restriksi kpmI yang memotong bagian “K” β-globin. Sehingga gen tk+ terletak pada gen β-globin. Hibridization dg 4,7 Kb β-globin, adanya band.

DNA Eksogen (Donor) diekspresi sementara pada beberapa sel segera setelah tranfeksi pada kultur sel

Transfeksi DNA yang bersifat sementara, hanya beberapa sel yang stabil Transfeksi DNA yang bersifat sementara, hanya beberapa sel yang stabil. Pada 24 jam pertama ikubasi tranfeksi mencapai 50%, namun inkubasi berikutnya % tranfeksi menjadi menurun. Kondisi ini disebut Transient phase.

Penambahan gen marker transefksi G418 sebagai selektor, menjadikan DNA plasmid stabil dalam DNA kromosom.

Rangsangan listrik (Elektroporasi) dapat digunakan untuk metode transfeksi pada tipe sel yang sulit dilakukan

Transfer gen dg bantuan elektroforasi Transfer gen dg bantuan elektroforasi. DNA ditranfeksi dalam sel wadah yang dialiri listrik, mampu menyebabkan lubang pada membran sel, sehingga DNA dg mudah masuk dalam sel kultur.

Sel tranforman segera dipanen pada phase transien (sebelum transforman hilang, atau diberi gen selektor agar transforman stabil)

DNA dapat melakukan penggabungan dengan lipid vesicle-lipossom sintetik dan mampu mengadakn fusi dengan membran sel,sehingga memungkinkan terjadi transfer DNA ke dalam sitoplasma

Liposom–mediated gen transfer (Lipofection) Metode encapsulte DNA (pembuatan capsul pembungkus DNA dari lipid sintetic)

Lipid sintetic mampu mengadakan fusi dg membrane sel, DNA asing mampu diekspresikan. Gb. 12.8

Vektor virus mempunyai potensi yang sangat efisien dalam memasukkan DNA asing dalam sel

Pemanfaatan Vektor virus SV40 Pemanfaatan Vektor virus SV40. Gen asing akan diekpresikan dalam sisi akhir gen promotor virus SV40. Genom virus rekombinant dipisahkan dg virus SV40 oleh enzym BamHI

Sel segera lisis melepaskan gen Sel segera lisis melepaskan gen. Sehingga virus dapat dipanen untuk medapatkan virus stock. Stock mampu menginfeksi banyak sel, sehingga protein dapat dihasilkan dari gen asing ini.

Vaccinia dan Baculovirus digunakan produksi protein dalam jumlah besar

Protein sebagai bahan obat dapat diproduksi pada hewan transgenik

Prinsip proses produksi protein yang menguntungkan untuk keperluan pengobatan atau kesehatan YPG = Your favorite gene

Bagaimana siklus hidup HIV dan usaha memproduksi protein yang mampu menghambat penyebaran HIV

Siklus hidup HIV-1. Virus HIV dibungkus oleh glikoprotein (gp 120 dan berikatan dg CD4 receptor pada permukaan sel. Selanjutnya masuk dalam sel.

Gen tat mengendalikan sintesis RNA virus Gen tat mengendalikan sintesis RNA virus. Penelitian aktivitas tat, melibatkan cotranfeksi dari plasmid yang mengandung genom HIV, bersama-sama dg plasmid reporter yang mengandung gen CAT (plasmid Chloramphenicol acetyltransferase) LTR: Long terminal Repiet.

Protease HIV dapat digunakan sebagai target pengobatan AIDS !!!

Perkembangan gen terapi pada manusia

Kelainan Cystic Fibrosis dapat diperbaiki secara invitro

Prinsip proses produksi protein yang menguntungkan untuk keperluan pengobatan atau kesehatan YPG = Your favorite gene