3. Pertumbuhan populasi mikrobia dalam batch culture Pertumbuhan Mikrobia Pertumbuhan selular (biosintesis komponen penyusun sel) Pertumbuhan populasi mikrobia 2.1. Batch culture 2.2. Continuous culture 3. Pertumbuhan populasi mikrobia dalam batch culture 3.1. Fase (kurva) pertumbuhan mikrobia dalam batch 3.1.1. Fase lag 3.1.2. Fase logaritmik (fase eksponensial) 3.1.3. Fase stasioner 3.1.4. Fase kematian

Kurva Pertumbuhan Populasi mikrobia

Microbial growth curve in batch culture

3.2. Analisis kuantitatif (matematika) pertumbuhan populasi mikrobia 3.2.1. Berdasarkan jumlah sel (N) 3.2.2. Berdasarkan biomasa sel (X) 4. Berdasarkan jumlah sel: 4.1. Parameter kinetika pertumbuhan populasi mikrobia 4.1.1. Jumlah generasi (n) 4.1.2. Konstanta kecepatan pertumbuhan rerata (k) 4.1.3. Waktu generasi (g; td) 5. Berdasarkan biomasa sel : 5.1. Konstanta kecepatan pertumbuhan spesifik (μ) 5.2. Hubungan antara k dan μ

6. Continuous culture 6.1. Khemostat 6.2. Besarnya populasi sel mikrobia 6.3. Hubungan antara kadar substrat dengan nilai μ dan μmaks 6.4. Hubungan antara kecepatan pertumbuhan dengan kecepatan penggunaan substrat 6.5. Hubungan antara kadar substrat (S) dengan kecepatan pengenceran (D) 6.6. Kurva steady state suatu khemostat

Pertumbuhan populasi mikrobia: Pembelahan Biner

Bersasarkan Jumlah sel Populasi selama fase Eksponensial Waktu (menit) Jmlh Pembelahan(generasi) (n) 2n Populasi sel (Nt=N0 x 2n) log Nt 20=1 1 x 1 = 1 0,00 20 1 21=2 1 x 2 = 2 0,301 40 2 22=4 1 x 4 = 4 0,602 60 3 23=8 1 x 8 = 8 0,903 80 4 24=16 1 x 16 = 16 1,204 100 5 25=32 1 x 32 = 32 1,505 120 6 26=64 1 x 64 = 64 1,806

Nt = No x 2n Nt : jumlah sel setelah tumbuh selama watu t Analisis Kuantitatif (Matematis) Pertumbuhan Populasi Mikrobia Nt = No x 2n Nt : jumlah sel setelah tumbuh selama watu t t : waktu pertumbuhan selama fase eksponensial N0: jumlah sel mula-mula selama fase eksponensial 2 : bilangan tetap (pembelahan biner) n : jumlah generasi (pembelahan)

Parameter kinetika pertumbuhan populasi mikrobia Jumlah generasi (n) Konstanta kecepatan pertumbuhan rerata (k) Waktu generasi (g) Konstanta kecepatan pertumbuhan spesifik (μ)

Matematika Pertumbuhan Jumlah generasi (n): n = (log Nt –log No)/(0,301) n = (ln Nt –ln N0)/(0,693) c. n = (2log Nt - 2log N0)

Konstanta kecepatan pertumbuhan rerata (k) k = jumlah generasi (n) per waktu pertumbuhan (t) k = n/t = (log Nt –log No)/(0,301 t) (jam-1) n = k x t  Nt = No x 2kxt

Waktu generasi (g) g: waktu yang diperlukan untuk melipatduakan populasi selama fase eksponensial g = 1/k =(0,301t)/(log Nt –log No) jam

Berdasarkan biomasa sel Konstanta kecepatan pertumbuhan instantaneous (spesifik)  μ dX/dt = μ X dX: perubahan biomasa selama waktu dt dt: perubahan waktu X: biomasa sel Jika diintegrasikan akan diperoleh: μ = lnXt –lnX0/t

Hubungan natar μ dan k Xt/X0 = eμt  Xt =X0.eμt Xt/X0 = 2  Xt = 2X0. (saat t = g)

Xt/X0 = eμt Xt/X0 = 2  t = g 2 = eμt ln 2 = ln eμt 0,693 = μt ln e 0,693 = μg  g = 1/k 0,693 = μ 1/k μ = 0,693 k

7. Teknik mengukur pertumbuhan populasi mikrobia 7.1. Berdasarkan jumlah sel 7.2. Berdasarkan biomasa sel 7.3. Berdasarkan aktivitas metabolisme

8. Enumerasi mikrobia 8.1.Total counts 8.2.Viable count Breed slide method Petroff-Houser chamber Haemocytometer 8.2.Viable count Spread-plate technique Pour-plate technique Filtration MPN (Most Probable Number) 8.3.Biomasa sel 8.4.Spectrophotometric

9. Berdasarkan biomasa sel 9.1. Berdasarkan berat kering 9.2. Berdasarkan total N 9.3. Berdasarkan kekeruhan (tubidimetri) 10. Berdasarkan aktivitas metabolisme 10.1. Produk metabolit 10.2. Pengurangan kadar substrat

Breed’s Slide method Sejumlah volume (0,1 ml) sampel dibuat preparat smear diatas gelas benda dengan luas tertentu (1 x 4 cm2) Difiksasi dan diwarnai dan dikeringkan Diamati di bawah mikroskop cahaya Densitas bakteri (sel/ml) = (As x N)/(Af x V) N: jumlah rerata sel/bidang pandang (sel) As: Luas area smear (As = 400 mm2) Af:: Luas bidang pandang (mm2) V: volume sampel (ml) DF: faktor pengenceran Densitas (sel/ml) = (400 x N x DF)/(x 1/10) Densitas (sel/ml) = (400 x N x DF x 10)/(Af )

Total count: Petroff-Hauser Chamber

Haemocytometer

Total count: Haemocytometer Luas kotak di tengah (L1) = 1 mm2 (dibagi 25 = 1/25 mm2) Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V1) = 1mm2 x 0,02 mm = 0,02 mm3 = 0,02 x 10-3 cm3 (1 cm3 = 1000 mm3) = 2 x 10-5 cm3 (= 2/105 cm3 =2/1000.000 cm3) =1/50.000 cm3 = 1/50.000 ml Contoh: Jika jumlah sel dalam kotak (L1) = 28 sel (= 28 per 1/50.000 ml) = 28 x 50.000 sel/ml = 1.400.000 sel/ml

Bidang Pandang

Luas kotak (L2) = 1/25 mm2 Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V2) = 1/25mm2 x 0,02 mm = 8 x 10-4 mm3 = 8 x 10-4 x 10-3 cm3 = 8 x 10-7 cm3 = 8 x 10-7 ml = 8/107 ml = 1/ 1.250.000 ml Contoh: Jika jumlah sel dalam kotak (L2) = 28 sel (= 28 sel per 1/1.250.000 ml) = 28 x 1.250.000 sel/ml = 35.000.000 sel/ml

Luas kotak (L3) = 1/400 mm2 Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V3) = 1/400 mm2 x 0,02 mm = 5 x 10-5 mm3 = 5 x 10-5 x 10-3 cm3 = 5 x 10-8 cm3 = 5 x 10-8 ml = 5/108 ml = 1/ 20.000.000 ml Contoh: Jika jumlah sel dalam 5 kotak (L2) = 500 sel Dalam 5 kotak L2 terdapat: 5 x 16 kotak L3 = 80 kotak L3 Maka Jumlah rerata sel per kotak L3 = 500/80 sel/1.20.000.000 ml = 6,25 sel/1.20.000.000 ml = 6,25 x 20.000.000 sel/ml

Petroff-Hausser Chamber Luas kotak terkecil (L) = 1/400 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,200 mm Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 0,200 mm3 = 1/400 x 2/10 mm3 = (1/400 x 2/10) x 1/1.000 cm3 = (2/4000) x 1/1000 cm3 = 2/4.000.000 cm3 = 1/2.000.000 ml

Haemocytometer Luas kotak terkecil (L) = 0,025 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,1 mm = 1/10 mm = 1/400 mm2 Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 1/10 mm3 = 1/4.000 mm3 = (1/4.000) x 1/1000 mm3 = 1/4.000.000 cm3 = 1/4.000.000 ml

Haemocytometer

Bidang pandang

Spermatozoa

Viable count Metode Pengenceran sample Plating pada medium padat dan inkubasikan Hitung jumlah koloni Kerapatan mikrobia/ml sample dapat dihitung: = jumlah koloni x faktor pengenceran Densitas mikrobia dinyatakan dengan CFU (colony Forming unit/ml) e.g. jika sampel yang diencerkan 10-6 x diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke dalam medium padat. Setelah diinkubasikan ditemukan sejumlah 50 koloni. Berapakah denistas (CFU/gr) mikrobia dalam sampel ?

Plate Count

Plate count

HPC: Heterotrophic Plate Count

Persayaratan Plate Count Jumlah koloni/petridish 30 – 300, jika tidak ada yang memenuhi, dipilih ang terdekat Koloni spreader tidak dipakai Perbandingan hasil pengenceran yang berurutan: jika  2 : hasilnya direrata jika > 2 : dipakai pengenceran yang lebih kecil 4. Jika ada ulangan maka jumlah koloni direrata

Kerapatan sel (cfu/ml) Perhitungan Pengenceran Jumlah koloni/Petridish Kerapatan sel (cfu/ml) 10-4 350 280 2.800.000 10-5 25 24 300 spreader 4.300.000 62 50 250 270 2.600.000 70 80

Membran filter Kerapatan sel sangat rendah: Sejumlah volume sampel difilter Filter diletakkan di atas medium Dihitung jumlah koloni yang tumbuh Dihitung kerapatan per volume sampel N.B. Metode ini digunakan jika kerapatan mikrobia dalam sampel sangat rendah !

Metode MPN Sampel diencerkan lalu diinokulasikan ke dalam medium cair Diinkubasikan lalu di amati adanya pertumbuhan mikrobia Kerapatan dihitung berdasarkan jumlah sampel yang positif tumbuh Jumlah tabung positif di antara 5 ulangan masing2 pengenceran 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 5 4 3 Jika dipilih ; 5 4 3 dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6 maka angka MPN untuk tiap 100 gram atau ml sampel: 280 x 10-5/100 ml sampel Angka 280 diperoleh dari Tabel MPN (Hoskins)

Metode Berat Kering (Biomasa) Kultur mikrobia disample dengan volume tertentu (ml) Dikeringkan pada 80°C sampai beratnya konstan Kerapatan dinyatakan dengan mg-DCW/ml atau g-DCW/ml

Metode Spektrofotometri Kultur cair mikrobia diambil Dimasukkan ke dalam kuvet Dibaca nilai OD pada panjang gelombang tertentu, mis OD-600 nm OD: Optical Density

Pengukuran pertumbuhan berdasarkan nilai OD 1 Klett unit = OD/0,002 (Madigan et al., 1997) 1 Klett unit = 500 x OD Measuring growth spectrophotometrically (OD) Convert OD to Klett unit by formula above Plot time vs growth (Klett unit) Calculate number of generation (n) by formula: n = (log Nt – log No)/0,301 Calculate generation time (g): g = t/n Calculate mean growth rate constant (k): k =1/g Calculate instantaneous growth rate constant (μ) : μ = 0,693k