KINETIKA PERTUMBUHAN DASAR REKAYASA BIOPROSES JURUSAN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

Pengertian Kinetika Kultivasi Sistem bioproses harus digambarkan secara kuantitatif Dgn kinetika fermentasi dapat diprediksi “yield” (rendemen) dan waktu yang diperlukan Kinetika fermentasi  mempelajari laju pertumbuhan sel, pembentukan produk dan konsumsi substrat yang dipengaruhi oleh berbagai kondisi proses (konsentrasi substrat, suhu, pH, O2 terlarut dll)

Pertumbuhan Sel dan Pembentukan Produk Pertumbuhan dan pembentukan produk oleh mikroba merupakan proses biokonversi dimana nutrien dikonversi menjadi biomassa dan metabolit Tiap konvrersi dapat dikuantifikasi dengan tetapan rendemen (yield coefficient)  dinyatakan sebagai massa sel atau produk yang etrbentuk per satuan massa substrat yang dikonsumsi (Yx/s dan Yp/s) Yx/s = Δ X/ Δ S Yp/s = Δ P/ Δ S tetapan rendemen menggambarkan efisiensi konversi substrat menjadi biomassa atau produk

Microbial Growth (Batch) Region 1: Lag phase microbes are adjusting to the new substrate (food source) Region 2 Exponential growth phase, microbes have acclimated to the conditions Region 3 Stationary phase, limiting substrate or electron acceptor limits the growth rate Region 4 Decay phase, substrate supply has been exhausted Microbial Growth (Batch)

Pertumbuhan Populasi Mikrobial

Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel  2  4  8 …. dst Selama fase eksponensial tsb.,tiap mikroba membelah diri pada interval tetap . : Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel  2  4  8 …. dst 1  21  22  23  24 …………..  2n = N (jumlah sel) Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi/penggandaan (diturunkan dari neraca massa) Waktu dimana populasi berjumlah dua kali selama waktu tertentu disebut “Waktu Generasi” (doubling time) = waktu penggandaan ( = td h-1)  Selama fase eksponensial tD relatif konstan

Organisme Waktu Penggandaan sel Bakteri dan khamir Kapang dan Alga Rumput Ayam Babi Sapi muda Manusia (muda) 20-120 menit 2-6 jam 1-2 minggu 2-4 minggu 4-6 minggu 1-2 bulan 3-6 bulan

Laju Pertumbuhan Spesifik Selama masa pertumbuhan eksponensial, sel berlipat ganda pada selang waktu tertentu n = jumlah penggandaan t = waktu (h) td = waktu penggandaan (h-1)  waktu yang diperlukan untuk menggandakan populasi sel menjadi 2X jumlah (kons) semula Xt = massa sel setelah waktu t X0 = massa sel pada waktu t = 0 Persamaan di atas menggambarkan pertumbuhan pada fase eksponensial dimana  konstant.

Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = tD) dengan laju spesifik pertumbuhan (µ) Hubungan antara tD dengan laju pertumbuhan spesifik  bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X0 menjadi X1 selama waktu penggandaan tD (= t 1- t0) : tD = 0.693/µ µ = 0.693/td

 pada setiap waktu pertumbuhan dapat ditentukan dari neraca massanya, sebagai berikut : Keterangan : F = laju alir V = volume kultur  = laju kematian spesifik Akumulasi sel = pertumbuhan – pengeluaran – sel yang mati Untuk Kultur Curah (Batch)

2. Laju Penggunaan Substrat Akumulasi Substrat = substrat masuk – substrat yang dikonsumsi untuk pertumbuhan – substrat yang dikonsumsi untuk sistesis produk – substrst yang dikonsumsi untuk pemeliharaan – substrat keluar F = Laju alir (l/jam) V = Volume kultur (l) S0 = [substrat yang masuk] (g/l) Yx/s = koefisien rendemen biomassa Yp/s = koefisien rendemen produk = laju pertumbuhan spesifik qp = laju pembentukan produk spesifik (g P/g sel.jam) m = koefisien pemeliharaan

Dari persamaan di atas terlihat sumber C digunakan untuk Untuk Kultur Curah Jika aerasi cukup , , dan tidak ada produk yang terbentuk, maka qs : laju penggunaan substrat spesifik (g S/g sel.jam) Laju penggunaan substrat spesifik (qs) Dari persamaan di atas terlihat sumber C digunakan untuk sintesis biomassa , pembentukan produk dan pemeliharaan sel

3. Laju pembentukan Produk Akumulasi produk = Produk yang disintesis – produk yang dikeluarkan dari bioreaktor – produk yang terdenaturasi P = konsentrasi produk (g/l)  = laju destruksi produk qp = laju pembentukan produk spesifik (g P/g sel.jam) Bila produknya stabil dan tidak dikeluarkan dari bioreaktor, maka Laju pembentukan produk spesifik (qp) (g P/g sel.jam)

Produk Metabolisme Sel dapat dibagi atas : Produk yang terkait /berasosiasi dengan pertumbuhan (metabolit primer) Produk yang langsung atau produk antara pada sistem metabolisme, seperti etanol dan vitamin Produk yang sebagian terkait dengan pertumbuhan Terbentuk pada sebagian phase pertumbuhan, seperti asam laktat. 1 dan 1 adalah berturut-turut koefisien yang berhubungan dengan pertumbuhan dan koefisien yang tak terkait dengan pertumbuhan Produk yang tak terkait dengan pertumbuhan (metabolit sekunder) Produk yang tidak penting untuk pertumbuhan, seperti antibiotik dan toksin qp = 

Metabolit Primer : qp = 1/X dP/dt = μ/Yx/p = 1/X dX/dt . dP/dX = 1/X dP/dt (terbukti) qs = 1/X dS/dt = μ/Yx/s = 1/X dX/dt . dS/dX = 1/X dS/dt (terbukti) qp = Yp/s .qs  Yp/s = qp / qs Campuran : dP/dt = α dX/dt + β X dibagi X  1/X dP/dt = α 1/X . dX/dt + β qp = α μ + β qp α β μ Contoh penentuan parameter kinetika produksi metabolit primer (biosurfaktan)

X P X P t t a b X P Keterangan : Pembentukan produk yang terkait dengan pertumbuhan Pembentukan produk yang sebagian terkait dengan pertumbuhan Pembentukan produk yang tidak terkait dengan pertumbuhan t c

Laju Pembentukan Produk & Penggunaan Substrat Spesifik(qp g P/g sel Laju Pembentukan Produk & Penggunaan Substrat Spesifik(qp g P/g sel.jam & qs g S/g sel.jam) : - tidak tergantung konsentrasi sel - menggambarkan efektivitas sel dlm mensintesis produk atau penggunaan ubstrat - berguna untuk membandingkan efektivitas hasil suatu fermentasi Laju Volumetrik (Q ; g/l.jam) : - tergantung dari konsentrasi sel - menggambarkan laju sintesis produk atau kebutuhan substrat untuk tiap satuan kapasitas volume bioreaktor Pola Pembentukan Produk : Pembentukan produk terkait/berasosiasi dengan pertumbuhan (growth associated) = Metabolit Primer Pembentukan produk tidak berasosiasi dengan pertumbuhan (non growth associated) = Metabolit Sekunder Campuran keduanya

YIELD UNTUK BIOMASSA DAN PRODUK  Mencerminkan efisiensi konversi substrat menjadi biomassa atau produk Yield (hasil) juga dapat ditentukan dari laju pembentukan biomassa atau produk, dan laju konsumsi substrat Koefisien yield tidak konstant selama pertumbuhan karena adanya konsumsi substrat untuk pemeliharaan Keterangan : Yx/s (0) = yield teramati SG = substrat yang dikonsumsi untuk pertumbuhan Sm = substrat yang dikonsumsi untuk pemeliharaan

Laju Penggunaan Substrat dalam Kultur Batch m : maintenance G : growth

Koefisien pemeliharaan ditentukan dengan cara memplot sehingga didapat suatu garis lurus dengan slope m m intercept Yx/s(0) = yield yang teramati Yx/s(G) = yield pertumbuhan yang sebenarnya m = koefisien pemeliharaan

PRODUKTIVITAS PADA KULTUR BATCH Produktivitas keseluruhan  X = konsentrasi akhir X0 = konsentrasi awal tT = waktu untuk persiapan sebelum running tD = waktu delay tL = waktu fase lag Dari persamaan di atas dapat diketahui pengaruh perubahan proses terhadap produkstivitas keseluruhan Contoh : * inokulum lbh banyak akan meningkatklan X0 dan memperpendek waktu proses * waktu delay lbh pendek akan memperpendek siklus

KULTUR SINAMBUNG Biomassa : Akumulasi = Sel masuk – Sel keluar + Pertumbuhan – Sel mati Bila suplai medium steril (X0 = 0) dan  >> , maka Dalam keadaan setimbang (staedy state), dan  = D Dcrit  max D mendekati Dcrit  tidak stabil D > max  wash out

Substrat : Akumulasi = nutrisi masuk – nutrisi keluar – konsumsi untuk tumbuh – konsumsi untuk pemeliharaan – konsumsi untuk sintesis produk

Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Model yang menghubungkan X, S dan D Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Biomassa Substrat

Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State) Substrat Biomassa

D kritis D kritis  D terendah saat mana wash out terjadi DC fungsi dari Sf . Bila Sf >> KS, maka DC = max

PRODUKTIVITAS Biomassa Produkstivitas P (g/l.jam) X = Yx/s (Sf –S) Sf D = Dc Ks - Sf D yang menghasilkan produktivitas maksimum, Dihitung dari turunan I pers = 0) Optimasi kultivasi dgn mengkompromikan : Produktivitas, yield konversi dan substrat sisa Produk

PENENTUAN KONSTANTA KINETIK DAN YIELD Penentuan max dan KS Memplotkan ln X vs t  Slope merupakan max Membalikkan Persamaan Monod dan memplotkan 3. Dengan mengoperasikan kultur sinambung chemostat pada kondisi yang sama pada 2 laju elusi. (D)  Ukur dari masing-masing dan hitung max dari persamaan : = Setelah didapat max, KS dapat dihitung dari persamaan :

CONTOH

C6H8O7 CITRIC ACID PRODUCTION Commercial production of citric acid is generally by submerged fermentation of sucrose or molasses using the filamentous fungus A. niger or synthetically from acetone or glycerol However synthetic methods proved to be unsuitable because of expensive or hazardous raw materials or an excessive number of reaction steps leading to low yields. C6H8O7 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid

APPLICATION Citric acid is produced either in the anhydrous form (crystallization from hot aqueous solutions ) or as the monohydrate (crystallization at temperatures below 36.6 ° C). Food : a. The dominant use of citric acid is as a flavoring and preservative in food and beverages (soft drinks). b. Citrate salts used to deliver those minerals in a biologically available form in many dietary supplements. Pharmaceutical : Used with sodium bicarbonate in effervescent formulae,for example in antacid and soluble aspirin preparation.

Cleaning and Chelating Agent excellent chelating agent, binding metals. It is used to remove scale from boilers and evaporators. soften water, which makes it useful in soaps and laundry detergents. By chelating the metals in hard water, it lets these cleaners produce foam and work better without need for water softening. active ingredient in some bathroom and kitchen cleaning solutions. Plastic Citric acid esters, particular triethyl, tributyl and acetyltributyl esters are employed as non-toxic plasticizers in plastic films used to protect food stuffs.

http://medicalmnemonics4u. blogspot. com/2009/11/citric-acid-cycle http://medicalmnemonics4u.blogspot.com/2009/11/citric-acid-cycle.html

Production of citric acid by Aspergillus niger using cane molasses in a stirred fermentor By Sikander Ali et al (Electron. J. Biotechnol. v.5 n.3 Valparaíso dic. 2002) The kinetics of submerged citric acid fermentation by Aspergillus niger using blackstrap molasses as the basal fermentation media. A laboratory scale stirred fermentor of 15-L capacity having working volume of 9-L was used for cultivation process and nutritional analysis. All fermentations were carried out following the growth on 150 g/l raw molasses sugars for 144 hours. Ferrocyanide (200 ppm) was used to control the trace metals present in the molasses medium.

Morphology of the mycelium : is crucial not only in relation to the shape of the hyphae , but also in the aggregation of the growth into small spherical pellets. The mycelial pellets should be small (0.2 to 0.5 mm) with a hard surface. This state of affairs is brought about by a deficiency of manganese in the medium or the obviously related additions of ferrocyanide ion.

Stock cultures of Aspergillus niger Citric acid monohydrate (g/l) Twelve (12) cultures of Aspergillus niger were screened for citric acid production Stock cultures of Aspergillus niger Dry cell mass (g/l) Sugar consumed (g/l) Citric acid monohydrate (g/l) % Yield* Mycelial morphology GCBT1 16.53 94.65 42.56 44.96 Small shiny pellets GCBT2 14.95 102.40 78.18 76.35 Intermediate pellets GCBT3 18.24 78.04 15.25 19.54 Gelatinous mass GCBT4 16.25 81.52 6.62 8.12 Viscous GCBT5 23.72 67.82 27.69 40.83 Dumpy mass GCBT6 14.75 87.64 11.04 12.60 GCBT7 20.05 91.45 84.95 92.89 GCBT8 19.12 97.60 72.98 74.77 Mixed pellets GCBT9 20.14 90.00 18.86 20.96 Gummy mass GCBT10 22.68 105.28 58.14 55.22 Small round pellets GCBT11 18.04 99.06 41.02 41.41 Fluffy mass GCBT12 19.55 89.95 13.34 14.83 Table 1. Screening of stock cultures for citric acid production. All the fermentations were carried out at 30�C following growth on 150 g/l initial sugar concentration. The initial pH of the molasses medium was kept constant at 6.0 throughout the fermentation period of 6-days. * based on the sugar consumed.

The higher producers of citric acid i. e The higher producers of citric acid i.e., GCBT2, 7 and 8 have been compared on the basis of : Citric acid formation parameters [Qp (g/l/h), Yp/s (g/g), Yp/x (g/g) and qp (g/g cells/h)] and Substrate consumption parameters [µ (h-1), Yx/s (g/g), Qs (g/l/h), Qx (g/g cells/h) and qs (g/g cells/h)].

Kinetic parameters: Qp: g citric acid produced/l/h; Yp/s: g citric acid produced/g substrate consumed: Yp/x: g citric acid produced/g cells formed; qp: g citric acid produced/g cells/h; μ (h-1): specific growth rate; Yx/s: g cells/g substrate utilized; Qs: g substrate consumed/l/h; Qx: g cell mass produced/l/h; qs: g substrate consumed/g cells/h.

Citric acid formation parameters - Qp (g/l/h) 0.543 0.590 0.507 Kinetic parameters GCBT2 GCBT7 GCBT8 Citric acid formation parameters - Qp (g/l/h) 0.543 0.590 0.507 Yp/s (g/g) 0.763 0.929 0.748 Yp/x (g/g) 5.229 4.237 3.817 qp (g/g cells/h) 0.036 0.029 0.026 Substrate consumption parameters μ (h-1) 0.540 0.589 0.506 Yx/s (g/g) 0.219 0.196 Qs (g/l/h) 0.711 0.635 0.678 Qx (g cells/l/h) 0.104 0.139 0.133 qs (g/g cells/h)� 0.047 0.032 0.035 Table 3. Kinetic parameters for citric acid production from molasses sugars following growth of Aspergillus niger strains. GCBT7  The values of specific rate constants (Qp, Qs and Qx in g/l/h) are more significant .& Yx/s , Yp/s and Yp/x are highly significant.

Nitrogen constituent has a profound effect on citric acid production because nitrogen is not only important for metabolic rates in the cells but it is also the basic part of cell proteins. Effect of different concentrations of ammonium nitrate (as nitrogen source for mycelial growth) on citric acid productivity by Aspergillus niger GCBT7 is shown in Figure 1. Any increase or decrease other than this concentration, resulted in the disturbance of fungal growth and subsequently citric acid production.

The maximum amount of citric acid (89. 64 ± 1 The maximum amount of citric acid (89.64 ± 1.5a g/l) was obtained when the concentration of NH4NO3 was kept at 0.2%. The growth rate constant (µ = 0.548 ± 0.02a g-1) indicated that enzyme to substrate ratio was optimum at 0.2% NH4NO3. Figure 1. Effect of different concentrations of ammonium nitrate on citric acid productivity by Aspergillus niger GCBT-7. Yp/s = g citric acid produced/g substrate consumed, Qp = g citric acid produced/l/h, μ (h-1) = specific growth rate, qs = g substrate consumed/g cells/h. http://www.scielo.cl/fbpe/img/ejb/v5n3/a10/f1.html

The maximum yield of citric acid (94. 93 ± 4 The maximum yield of citric acid (94.93 ± 4.2a g/l) was achieved, 144 hours after inoculation. The sugar consumption and dry mycelial weight were 92.94 and 16.15 g/l, respectively. Figure 2a. Time course study during citric acid fermentation by Aspergillus niger GCBT7 in blackstrap molasses.

The culture of Aspergillus niger GCBT7 was selected as the best mould to support maximum production of citric acid without supplements. The observation indicates that it might be possible to manipulate the morphology parameters in order to improve bioreactor performance and process yields. Substrate requirement as well as biomass and product yields are some of the basic parameters that need to be considered in determining the feasibility of the fermentation process. All the kinetic parameters i.e., product and growth yield coefficients (Yp/s, Yp/x and Yx/s in g/g), volumetric rates (Qp, Qs and Qx in g/g cells/h) and specific rate constants (qp, qs and qx in g/g/h) are highly significant. The culture of Aspergillus niger GCBT7 was selected as the best mould to support maximum production of citric acid without supplements. The observation indicates that it might be possible to manipulate the morphology parameters in order to improve bioreactor performance and process yields. Substrate requirement as well as biomass and product yields are some of the basic parameters that need to be considered in determining the feasibility of the fermentation process. All the kinetic parameters i.e., product and growth yield coefficients (Yp/s, Yp/x and Yx/s in g/g), volumetric rates (Qp, Qs and Qx in g/g cells/h) and specific rate constants (qp, qs and qx in g/g/h) are highly significant. The culture of Aspergillus niger GCBT7 was selected as the best mould to support maximum production of citric acid without supplements. The observation indicates that it might be possible to manipulate the morphology parameters in order to improve bioreactor performance and process yields. Substrate requirement as well as biomass and product yields are some of the basic parameters that need to be considered in determining the feasibility of the fermentation process. All the kinetic parameters i.e., product and growth yield coefficients (Yp/s, Yp/x and Yx/s in g/g), volumetric rates (Qp, Qs and Qx in g/g cells/h) and specific rate constants (qp, qs and qx in g/g/h) are highly significant. Concluding Remarks The culture of Aspergillus niger GCBT7 was selected as the best mould to support maximum production of citric acid without supplements. The observation indicates that it might be possible to manipulate the morphology parameters in order to improve bioreactor performance and process yields. Substrate requirement as well as biomass and product yields are some of the basic parameters that need to be considered in determining the feasibility of the fermentation process. All the kinetic parameters i.e., product and growth yield coefficients (Yp/s, Yp/x and Yx/s in g/g), volumetric rates (Qp, Qs and Qx in g/g cells/h) and specific rate constants (qp, qs and qx in g/g/h) are highly significant.

SELESAI DEH