PEMANFAATAN & PENGELOLAAN HEWAN COBA DALAM EVALUASI GIZI PANGAN (in vivo test) By. Jaya Mahar Maligan Laboratorium Nutrisi Pangan dan Hasil Pertanian PS- Ilmu dan Teknologi Pangan Jurusan Teknologi Hasil Pertanian FTP - UB

Introduction Food Human Body Nutrition Metabolism In Vitro Test Functional Benefit In Vitro Test Nutrition In Vivo Test

In Vivo Test In vivo (Latin for "within the living") is experimentation using a whole, living organism as opposed to a partial or dead organism, or an in vitro controlled environment. Animal testing and clinical trials are two forms of in vivo research. In vivo testing is often employed over in vitro because it is better suited for observing the overall effects of an experiment on a living subject. (Wikipedia, 2010)

Pemeliharaan dan pengembangbiakan hewan coba 6 Prinsip : 1. Lingkungan -> stabil dan sesuai untuk keperluan fisiologis (suhu, kelembapan dan kecepatan aliran udara) 2. Status Kesehatan -> kesehatan kandang, gedung dan lingkungan

Pemeliharaan dan pengembangbiakan hewan coba 6 Prinsip : 3. Pegawai (perawat hewan) -> senang dan empati, kompeten dan profesional 4. Kualitas dan Kuantitas Pakan (feed) -> cukup dalam segi nutrisi, wadah bersih dan bebas kontaminan

Pemeliharaan dan pengembangbiakan hewan coba 6 Prinsip : 5. Sistem Pengelolaan dan Pembiakan -> fungsi pengawasan, dokumentasi 6. Kualitas Hewan -> sehat, SPF (specific pathogen free) dan germ-free

Animal Testing Pemanfaatan Hewan Coba di Laboratorium Diternakkan khusus untuk keperluan invivo test Sebagai model untuk melihat pengaruh metabolisme nutrisi secara langsung pada jaringan biologis hewan coba

Animal Testing Sehat, SPF (Specific Pathogen Free) , germ-free Kondisi metabolisme hewan coba yang serupa dengan manusia Tingkat reproduksi tinggi Kesesuaian dengan tujuan penelitian

Animal Testing Rodensia dan Kelinci Tikus (Rattus norvegicus), Mencit (Mus musculus), Guinea pig, Kelinci : penelitian penyakit parasit, infeksi dan degeneratif, nutrisi, reproduksi, toksisitas Carnivora Kucing dan Anjing : penelitian fisiologi, sistem syaraf dan praktek bedah, cancer dan tumor, toksisitas, metabolisme dan evaluasi obat

Animal Testing Primata Kera : penelitian infeksi, metabolisme dan toksisitas obat Ungulata Sapi, kambing, kuda : penelitian infeksi, produksi antiserum dan antitoksin Unggas Telur : penelitian virology

Animal Welfare 3R (Russel and Burch) Replacement : Setiap metode yg menggunakan materi yang tidak dapat merasa (non-sentient material) sebagai pengganti metode yg menggunakan vertebrata hidup yg mempunyai kesadaran. Seperti contohnya dengan menggunakan teknologi canggih dengan komputer modeling, daripada menggunakan hewan asli yang hidup Reduction : Mengurangi jumlah hewan digunakan untuk memperoleh sejumlah informasi dan ketetapan tertentu. Dari satu ekor hewan saja dapat digunakan untuk beberapa kali ataupun penelitian yang berbeda. Jangan sampai membuang-buang atau memboroskan organ yang tidak digunakan. Gunakan seefisiensi mungkin dari satu ekor hewan percobaan. Refinement : Pengurangan indikasi atau keparahan (severity) prosedur yang tidak berperikemanusiaan (inhumane) yang diterapkan pada hewan harus digunakan. Sedapat mungkin kita mengurangi rasa sakit yang dirasakan oleh hewan yang diujicobakan. Gunakan prosedur yang baik untuk “memakai” mereka.

Animal Welfare Five (5) Freedom : World Society for Protection of Animals (WSPA) Freedom from hunger and thirst (bebas dari rasa lapar dan haus). Freedom from discomfort (bebas dari rasa panas dan tidak nyaman). Freedom from pain, injury, and disease (bebas dari luka, penyakit dan sakit). Freedom from fear and distress (bebas dari rasa takut dan penderitaan). Freedom to express normal behavior (bebas mengekspresikan perilaku normal dan alami)

Mencit Data Biologis - Konsumsi pakan per hari - Konsumsi air minum per hari - Diet protein - Ekskresi urine per hari - lama hidup - Bobot badan dewasa Jantan Betina - Bobot lahir - Dewasa kelamin (jantan=betina) - Siklus estrus (menstruasi) - Umur sapih - Mulai makan pakan kering - Rasio kawin - Jumlah kromosom - Suhu rektal - Laju respirasi - Denyut jantung - Pengambilan darah maksimum - Jumlah sel darah merah (Erytrocyt) - Kadar haemoglobin(Hb) - Pack Cell Volume (PCV) - Jumlah sel darah putih (Leucocyte) 5 g (umur 8 minggu) 6,7 ml (umur 8 minggu) 20-25% 0,5-1 ml 1,5 tahun 25-40 g 20-40 g 1-1,5 g 28-49 hari 4-5 hari (polyestrus) 21 hari 10 hari 1 jantan – 3 betina 40 37,5oC 163 x/mn 310 – 840 x/mn 7,7 ml/Kg 8,7 – 10,5 X 106 / μl 13,4 g/dl 44% 8,4 X 103 /μl

Tikus putih Data Biologis - Konsumsi pakan per hari - Konsumsi air minum per hari - Diet protein - Ekskresi urine per hari - lama hidup - Bobot badan dewasa Jantan Betina - Bobot lahir - Dewasa kelamin (jantan=betina) - Siklus estrus (menstruasi) - Umur sapih - Mulai makan pakan kering - Rasio kawin - Jumlah kromosom - Suhu rektal - Laju respirasi - Denyut jantung - Pengambilan darah maksimum - Jumlah sel darah merah (Erytrocyt) - Kadar haemoglobin(Hb) - Pack Cell Volume (PCV) - Jumlah sel darah putih (Leucocyte) 5 g/100 g bb 8-11 ml/100 g bb 12% 5,5 ml/100 g bb 2,5- 3 tahun 300-400 g 250-300 g 5-6 g 50+10 hari 5 hari (polyestrus) 21 hari, 40-50 g 12 hari 1 jantan – 3 atau 4 betina 42 37,5oC 85 x/mn 300 – 500 x/mn 5,5 ml/Kg 7,2-9,6 X 106 / μl 15,6 g/dl 46% 14 X 103 /μl

Teknik Eksperimen Pemeliharaan dan handling Identifikasi Pengambilan spesimen / sampling Anastesi dan eutanasia

Pemeliharaan Individual Cage atau Metabolic Cage Kandang mudah dibersihkan Alas tidur dibersihkan secara periodik

Handling - Mencit

Identifikasi - mencit Penandaan Hewan Coba -> pembeda perlakuan Temporer dan Permanen Spot Tail / Numbered Tail, Ear Tag, Ear Piece, Tail Tatto, Electronic Transponder

Pemberian Materi Injeksi intraperitoneal, subkutan, intravena, intramuskular Sonde intragastrik (per oral) Dosis tertentu mis : sonde mencit 20 gr (maks 1ml) sonde tikus 200 gr (maks 5 ml)

Sampling Pengambilan darah -> ≠ shock hipovolemic 10% total volume darah, interval 2-4 minggu 1% interval 24 jam Vena lateral ekor, sinus orbitalis mata, vena saphena (kaki), jantung (intrakardial)

Euthanasia Eutanasia (Bahasa Yunani: ευθανασία -ευ, eu yang artinya "baik", dan θάνατος, thanatos yang berarti kematian) praktek pencabutan kehidupan manusia atau hewan melalui cara yang dianggap tidak menimbulkan rasa sakit atau menimbulkan rasa sakit yang minimal Inhalasi CO2, Injeksi barbiturat over dosis (200mg/kg BB), dekapitasi, dan dislokasi.

Anesthesia from Greek αν-, an-, "without"; and αἴσθησις, aisthēsis, "sensation"), traditionally meant the condition of having sensation (including the feeling of pain) blocked or temporarily taken away. Tujuan anastesi : mengurangi rasa sakit dan rasa tidak enak pada segala kondisi (ex : selama pemeriksaan dan pembedahan) Tikus dan mencit : Metode fisik, parenteral dan inhalasi

Anesthesia Metode fisik : hipothermia Metode parenteral : pentobarbital (30-70 mg/kg BB), Ketamine (50- 400 mg/ kg BB), etc Metode Inhalasi : CO2 (1 mnt), Chloroform, Ether, halothane, etc

Handling - Tikus

Identifikasi- Tikus Identifikasi Hewan Coba -> pembeda perlakuan Temporer dan Permanen Spot Tail / Numbered Tail, Ear Tag, Ear Piece, Tail Tatto, Electronic Transponder

Sampling Pengambilan darah -> shock hipovolemic 10% total volume darah, interval 2-4 minggu 1% interval 24 jam Vena lateral ekor, ventral arteri ekor, sinus orbitalis mata, vena saphena (kaki), arterior vena cava, jantung

Euthanasia Eutanasia (Bahasa Yunani: ευθανασία -ευ, eu yang artinya "baik", dan θάνατος, thanatos yang berarti kematian) praktek pencabutan kehidupan manusia atau hewan melalui cara yang dianggap tidak menimbulkan rasa sakit atau menimbulkan rasa sakit yang minimal Inhalasi CO2, Injeksi barbiturat over dosis (200mg/kg BB) atau ketamin (60-70mg/kg BB), dekapitasi, dan dislokasi.

Perhitungan Dosis Dosage Converse (Laurence & Bacharah, 1964) Konversi dosis dari manusia (70 kg) ke : a. mencit (20 g) = 0.0026 b. tikus (200 g) = 0.0018 Konversi sederhana BB manusia – mencit atau tikus

Aplikasi Invivo test - nutrisi Bioavailability Test (Nutrition) Meal Tolerance test (glycemic index) Blood : Diabetic, Artheroschlerosis test Tissue : Carcinoma test, Antioxidant test Caecum : Probiotic , SCFA test Brain : Omega 3 and phospolipid incorporation etc.. etc..

Aplikasi Invivo test - nutrisi EFEK HIPOKOLESTEROLEMIK TEPUNG UMBI GADUNG PADA TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET HIPERKOLESTEROL BY. JAYA MAHAR MALIGAN, TETI ESTIASIH, WENNY B. SUNARHARUM DAN THOMAS RIANTO

Latar Belakang Potensi yang masih belum tergali dengan optimal Senyawa Bioaktif Meningkatkan Derajat Kesehatan Menurunkan Resiko Penyakit Jantung Koroner (PJK) Gadung (Dioscorea hispida Dennst) Mencegah Dislipidemia dengan Memperbaiki Profil Lipid (HDLc, LDLc, TG dan TK)

Tujuan Penelitian Mengetahui efek hipokolesterolemik tepung umbi gadung (Dioscorea hispida Densst) terhadap tikus Rattus novergicus strain wistar jantan yang diberi diet tinggi lemak (aterogenik) melalui pengujian profil lipid (LDL-c, HDL-c, Kolesterol Total dan Trigliserida).

Diet hiperkolesterol (AIN-93M) Komponen Komposisi (g/kg diet) Standar (AIN-93M) Hiperkolesterol Tepung jagung 620,692 440,66 Kasein 140 Sukrosa 100 Minyak kedelai 40 Serat 50 Campuran mineral 35 Campuran vitamin 10 Lemak sapi 180 L-sistin 1,8 Kolin bitartrat 2,5 TBHQ 0,008 0,04 Kolesterol 0,196 Total (g) 1000

Metodologi Penelitian Desain Penelitian : Control Group Post Test Design Tahapan Pelaksanaan Penelitian 1. Persiapan dan Pemilihan Hewan Coba 2. Formulasi Diet Aterogenik 3. Pembuatan Tepung Umbi Gadung (Syafii,dkk.2005) 4. Pemberian Asupan Tepung Gadung pd Hewan Coba 5. Pengumpulan dan Analisis Data

Adaptasi 7 hari dg diet normal (AIN-93M) Tikus Wistar Jantan Adaptasi 7 hari dg diet normal (AIN-93M) Diet AIN-93M Diet hiperkolesterol Diet hiperkolesterol + tepung gadung (Pemeliharaan tikus selama 28 hari) Penimbangan berat pakan yang dikonsumsi tiap hari Penimbangan BB tikus tiap 7 hari Pengujian Profil Lipid (HDLc,LDLc,TK dan TG) pd hari ke-28 Hasil

Hasil penelitian

Hasil penelitian

Hasil penelitian

Aplikasi Invivo test - nutrisi SIFAT BIOAKTIF FOSFOLIPID TERSTRUKTUR DARI LESITIN KEDELAI KOMERSIAL MENGANDUNG ASAM LEMAK OMEGA-3 HASIL SAMPING PENGALENGAN IKAN TUNA BY. JAYA MAHAR MALIGAN, TETI ESTIASIH DAN JONI KUSNADI

Latar Belakang Minyak Hasil Samping Pengalengan Ikan Tuna Lesitin Kedelai Komersial Kristalisasi pelarut suhu rendah Asam Lemak Omega-3 Fosfolipid Rx. Asidolisis Enzimatis Kestabilan rendah Karakterisasi Sifat Bioaktif : Uji Invivo Fosfolipid Terstruktur

Tujuan Penelitian Mengkaji kondisi proses sintesis fosfolipid terstruktur mengandung asam lemak omega-3 dari lesitin kedelai komersial dan minyak kaya asam lemak omega-3 dari hasil samping pengalengan tuna.

Tujuan Penelitian Mengkarakterisasi sifat bioaktif fosfolipid terstruktur dalam menurunkan resiko aterosklerosis menggunakan uji invivo pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague dawley jantan. Menguji tingkat inkorporasi DHA fosfolipid terstruktur pada jaringan otak tikus putih (Rattus norvegicus) strain sprague dawley jantan.

Hipotesis Penelitian Diduga konsentrasi enzim dan lama reaksi asidolisis akan berpengaruh terhadap tingkat inkorporasi EPA-DHA pada fosfolipid terstruktur. Diduga pemberian fosfolipid terstruktur, lesitin kedelai komersial dan minyak kaya asam lemak omega-3 pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley jantan yang diberi diet aterogenik akan memberikan pengaruh yang berbeda dalam menurunkan resiko aterosklerosis dan perlemakan hati (steatosis).

Hipotesis Penelitian Diduga pemberian fosfolipid terstruktur, lesitin kedelai komersial dan minyak kaya asam lemak omega-3 pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley jantan akan memberikan pengaruh yang berbeda terhadap tingkat inkorporasi DHA pada jaringan otak.

Tahapan Penelitian Sintesis asidolisis enzimatis dan karakterisasi kimia fosfolipid terstruktur mengandung asam lemak omega-3 dari fosfolipid kedelai dan minyak kaya asam lemak omega-3. Pengujian sifat bioaktif fosfolipid terstruktur melalui uji invivo pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley jantan

Tahap 1 - Sintesis Asidolisis Enzimatis Desain Penelitian Tahap 1 - Sintesis Asidolisis Enzimatis Rancangan Acak Kelompok Faktor 1. Lama Reaksi : 18, 24,36 jam Faktor 2. Konsentrasi Enzim : 20,30,40% Analisis Data : Anova dan Uji Lanjut Post Hoc Tuckey and Duncan (α = 0.05)

Tahap 2 – Pengujian Sifat Bioaktif Fosfolipid Terstruktur Desain Penelitian Tahap 2 – Pengujian Sifat Bioaktif Fosfolipid Terstruktur P0 : diet standart AIN-93M P1 : diet aterogenik P2 : diet aterogenik + lesitin kedelai komersial P3 : diet aterogenik + minyak kaya asam lemak omega-3 P4 : diet aterogenik + fosfolipid terstruktur  @ 4 ekor tikus (design experiment : nested , uji lanjut : Tukey)

Fosfolipid Terstruktur Fosfolipid Terstruktur Perlakuan Terbaik 3 Perlakuan Rerata Kadar EPA-DHA (mg/g) Persentase Relatif (%) 18 jam : 20% (L1K1) 64,69 50,57 18 jam : 30% (L1K2) 127,47 51,04 18 jam : 40% (L1K3) 119,95 46,05 24 jam : 20% (L2K1) 56,70 49,79 24 jam : 30% (L2K2) 62,11 51,58 24 jam : 40% (L2K3) 134,69 46,04 36 jam : 20% (L3K1) 95,62 46,39 36 jam : 30% (L3K2) 49,71 49,82 36 jam : 40% (L3K3) 115,67 49,92 3d Fosfolipid Terstruktur Perlakuan Terbaik

4 4a 4b 4c 4d Pengujian Sifat Bioaktif Fosfolipid Terstruktur Profil Lipid Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-media Aorta 4b Histopatologi Perlemakan Hati dan Tingkat Kerusakan Sel Hati 4c 4d Tingkat Inkorporasi DHA di Otak

4a Profil Lipid Total Kolesterol P0 P1 P2 P3 P4 Rerata TK Minggu 0 (mg/dl) 104,42 215,64 231,92 226,99 212,56 Rerata TK Minggu 10 (mg/dl) 109,42 253,64 233,57 192,26 134,21 Rerata Rerubahan TK (mg/dl) 4,85c 38,00c 1,64bc -34,72b -78,36a

4a Profil Lipid Total Trigliserida P0 P1 P2 P3 P4 Rerata TG Minggu 0 (mg/dl) 64,36 114,65 109,57 117,97 104,9 Rerata TG Minggu 10 (mg/dl) 68,55 162,28 111,90 94,44 84,92 Rerata Rerubahan TG (mg/dl) 4,20b 50,63c 2,33b -23,52a -94,57a

4a Profil Lipid Kadar HDL P0 P1 P2 P3 P4 Rerata HDL Minggu 0 (mg/dl) 57,12 52,56 56,67 55,26 55,96 Rerata HDL Minggu 10 (mg/dl) 56,31 43,82 54,46 57,64 68,60 Rerata Rerubahan HDL (mg/dl) -0,87b -8,74c -2,21b 2,39a 12,64a

4a Profil Lipid Kadar LDL P0 P1 P2 P3 P4 Rerata LDL Minggu 0 (mg/dl) 34,44 140,15 153,34 148,14 135,70 Rerata LDL Minggu 10 (mg/dl) 39,26 176,77 156,73 115,73 48,62 Rerata Rerubahan LDL (mg/dl) 4,82d 36,32cd 3,39c -32,41b -87,08a

Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-media Aorta FC 100µm P2 E L 100µm P4 L 100µm Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-media Aorta 4b

Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-Media Aorta Rerata IMT (µm) 103,81a 214,02c 206,52c 140,21b 131,82b

Histopatologi Perlemakan Hati dan Tingkat Kerusakan Sel hati 4c

Histopatologi Perlemakan Hati dan Tingkat Kerusakan Sel hati 4c P0 P1 P2 P3 P4 Rerata Tingkat Kerusakan Sel Hati (%) 3,61a 48,98d 39,44c 15,36b 5,06a

Tingkat Inkorporasi DHA di Otak Rerata Kadar DHA (mg/g) 1,82a 1,74a 2,37a 65,88ab 224,96c Rerata Persentase Relatif (%) 0,62a 0,44a 0,54a 12,45b 17,18c

Thank you for your attention April, 2013