Oleh: TINA DEWI ROSAHDI 20506001 Defosforilasi dan Aktivasi PDH-E1α pada Rangka Otot Manusia Selama Bergerak Pengaruh Infusi Intralipid Oleh: TINA DEWI ROSAHDI 20506001

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, VOL. 55, PDH-E1α Dephosphorylation and Activation in Human Skeletal Muscle During Exercise Effect of Intralipid Infusion Henriette Pilegaard, Jesper B. Birk, Massimo Sacchetti, Marina Mourtzakis, D. Graham Hardie, Greg Stewart, P. Darrell Neufer, Bengt Saltin, Gerrit van Hall, and F. P. Wojtaszewski AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, VOL. 55, NOVEMBER 2006 Maret 2007 Metabolisme Biokimia

PENDAHULUAN Keadaan fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan sisi 2 diharapkan menjadi sisi fosforilasi penting pada aktivitas PDHa dalam rangka otot. Asumsi : uji aktivitas in vitro mengukur aktivitas PDH dalam bentuk aktif mencerminkan keadaan fosforilasi dan bukan merupakan modifikasi kovalen. Diperlukan penjelasan peran sisi fosforilasi spesifik untuk aktivitas PDHa dan peran regulator PDH kinase/fosfatase. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

TUJUAN Menyelidiki fosforilasi subunit piruvat dehidrogenase (PDH)-E1α. Menyelidiki apakah asam lemak bebas (FFAs) meregulasi aktivitas PDH. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Komplek Piruvat Dehidrogenase PDC merupakan komplek multienzim yang dilibatkan dalam dekarboksilasi piruvat, proses yang berhubungan dengan glikolisis dan TCA. Komponen PDC Enzim Lambang JumlahCopi Gugus Prostetik Piruvat dehidrogenase E1 30 TPP Dihidrolipoil transasetilase E2 Lipoamid Dihidrolipoil dehidrogenase E3 12 FAD Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Komplek Piruvat Dehidrogenase Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Ikatan pada komponen PDC; PDH, E3, PDHKs (PDKs) dan PDPs Maret 2007 Metabolisme Biokimia

PDH-E1α PDH E1 adalah heterotetramer subunit 2α dan 2β. Mengkatalisis dekarboksilasi piruvat. Distimulasi oleh insulin. Diinhibisi oleh ATP, NADH, dan asetil-CoA. Meregulasi aktivitas komplek PDC oleh fosforilasi-defosforilasi tiga residu serin spesifik pada subunit E1α. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Struktur PDH-E1 Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Mekanisme regulasi aktivitas PDK dan PDP PDK dan PDP adalah regulator enzim yang mengkatalisis interkonversi PDC diantara bentuk aktifnya (defosforilasi) dan bentuk tidak aktif (fosforilasi). Keseimbangan siklus fosforilasi/defosforilasi ditentukan oleh aktivitas relatif PDK dan PDP. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

MODEL DAN METODE PENELITIAN Subyek Penelitian Parameter Darah Glikogen Otot Isolasi RNA, Transkripsi Balik, dan Kandungan cDNA Real-Time PCR Antibodi PDH Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α Preparasi Mitokondria Homogenat/Lisat Otot Manusia Aktivitas PDHa Statistik Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Subyek Penelitian Tujuh orang yang sehat - umur 25,4 ± 1,3 tahun - tinggi 181 ± 2 cm - berat 74 ± 3 kg) Diambil darahnya  biopsi otot  infusi intralipid dan kontrol - Contoh darah diambil sebelum infusi dan pada 60, 90, 120, 180, 210, dan 240 menit istirahat selama infusi dan setiap 30 menit selama 3 jam bergerak. - Biopsi otot diperoleh sebelum infusi dimulai, pada 4 jam istirahat dan setelah 45, 90, 135, dan 180 menit bergerak. 4 jam istirahat (terlentang), kemudian 3 jam menggerakkan lutut kedua kaki. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Parameter Darah Konsentrasi plasma FFA ditentukan menggunakan kit Wako FA dan spektrofotometer otomatis. Konsentrasi plasma insulin ditentukan menggunakan insulin enzyme-linked immunosorbent assay kit. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Sample otot bebas darah, lemak, dan jaringan penghubung Glikogen Otot Sample otot beku Sample otot bebas darah, lemak, dan jaringan penghubung Unit glikosil Dikeringkan Dianalisis Dihidrolisis dengan asam menggunakan Spektrofotometer otomatis Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Isolasi RNA, Reverse Transcription, dan Kandungan cDNA Isolasi RNA: 220 mg jaringan otot Total RNA Reverse Transcription: sistem Superskrip II RNase H- dan Oligo dT. Bisa dihitung jumlah single-stranded DNA jika ditambah Reagen OliGreen. Kandungan total cDNA: hasil normalisasi jumlah target cDNA. Diisolasi dengan metode ekstraksi guanidium tiosianat-fenol-kloroform Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Urutan primer dan probe TaqMan yang digunakan untuk real-time PCR Kandungan mRNA ditentukan dengan PCR menggunakan uji fluorogenik 5’ nuklease Tabel 1 Urutan primer dan probe TaqMan yang digunakan untuk real-time PCR Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Antibodi PDH Tiga poliklonal antibodi anti-PDH PDH Bebas PDH yang dikenali Ser293 (sisi 1) PDH yang dikenali Ser300 (sisi 2) Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α 8 mg rangka otot tikus homogen, mitokondria, fraksi sitosolik (remnant) Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α SDS-PAGE + Antibodi  Western blotting Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α Homogenat rangka otot manusia, lisat, pellet SDS-PAGE + Antibodi  Western blotting Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α 4 μg protein lisat otot Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α SDS-PAGE + Antibodi  Western blotting Uji spesifisitas antibodi  uji kompetisi peptida Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α Sample otot Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α dipotong Otot Lisis 3 μg lisat +/- λ-P dan/atau PI SDS-PAGE, Western blotting Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Preparasi Mitokondria 250 g gastrocnemius otot tikus Suspensi Homogenat Diiris + KCl, Tris-HCl, basa-Tris, NaF, Na3VO4, Na4P2O7, EDTA, EGTA, Benzamidin Dirotasi, 15’ Homogenisasi dengan politron disentrifugasi Supernatan Mitokondria (pellet) + buffer Tris-EDTA + Inhibitor protease Kontrol sitosolik Suspensi Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Homogenat/Lisat Otot Manusia Sample otot beku Sample otot bebas darah, lemak, dan jaringan penghubung Dikeringkan Dianalisis Dihidrolisis dengan asam menggunakan Spektrofotometer otomatis Supernatan Pellet Diambil Didinginkan dalam nitrogen cair, disimpan pada -800C Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Aktivitas PDHa 8-15 mg jaringan otot homogenat Dihomogenisasi pada es, 50’’ Menggunakan Homogenizer glass micro Ditentukan aktivitas PDHa Maret 2007 Metabolisme Biokimia

HASIL DAN PEMBAHASAN FFAs FFAs berperan dalam disregulasi PDH pada model binatang pengerat diabetes tipe 2. Efisiensi pemutusan triasilgliserol diberikan pada emulsi intralipid infusi saline (kontrol) (●) infusi intralipid/heparin (intralipid) (○) Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Insulin Makanan pagi yang dikonsumsi subyek meningkatkan sedikit plasma insulin pada awal infusi. Pada 4 jam masa istirahat  konsentrasi arterial plasma insulin pada kontrol menurun, pada intralipid tidak ada perubahan. Infusi intralipid menimbulkan daya tahan insulin otot dan melemahkan aktivasi PDHa oleh insulin. Diabetes tipe 2 berhubungan dengan peningkatan fosforilasi PDH-E1α selama istirahat dan fosforilasi mengurangi aktivitas PDHa pada stimulasi insulin. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Glikogen otot Pada 4 jam masa istirahat  tidak ada perubahan glikogen otot pada kedua percobaan. Selama 45 menit awal bergerak  konsentrasi glikogen otot menurun pada kedua percobaan. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Aktivitas PDH dalam bentuk aktif (PDHa) infusi saline (kontrol) (■) infusi intralipid/heparin (intralipid) (□) Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Aktivitas PDH dalam bentuk aktif (PDHa) Infusi intralipid mempertahankan peningkatan aktivitas yang lebih daripada penurunan aktivitas PDHa selama bergerak  induksi FFA yang menginhibisi aktivitas PDK. Peningkatan plasma FFA tidak menimbulkan sinyal yang menginduksi penghematan karbohidrat dalam rangka otot. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Protein PDH-E1α dan keadaan fosforilasi Fosforilasi PDH-E1α sisi 1 Gerakan yang dilakukan menginduksi penurunan fosforilasi pada sisi 1 dan 2 pada subunit katalitik dalam PDH-E1α pada komplek PDH. B: Representative blot protein PDH-E1α dan fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan 2. Fosforilasi PDH-E1α sisi 2 infusi saline (kontrol) (■) infusi intralipid/heparin (intralipid) (□) Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Protein PDH-E1α dan keadaan fosforilasi Peningkatan fosforilasi PDH-E1α pada saat istirahat selama infusi intralipid tidak merusak regulasi aktivitas PDHa selama bergerak. Mekanisme regulator yang diaktivasi selama bergerak mengesampingkan regulasi yang digunakan oleh peningkatan FFAs pada saat istirahat. Gerakan bisa mengatasi disregulasi aktivitas PDH pada saat istirahat dalam diabetes tipe 2. Metabolisme lipid dan glukosa, normal selama bergerak pada otot penderita diabetes tipe 2. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Mengindikasikan kesamaan dan regulasi gabungan di kedua sisi. A: Hubungan diantara fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan aktivitas PDHa. B: Hubungan diantara fosforilasi PDH-E1α sisi 2 dan aktivitas PDHa. C: Hubungan diantara fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan 2. Tingkat fosforilasi PDH-E1α berhubungan terbalik dengan aktivitas PDHa selama bergerak. Mengindikasikan kesamaan dan regulasi gabungan di kedua sisi. Defosforilasi pada sisi terjadi pada keadaan acak. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Kandungan PDK dan PDP mRNA infusi saline (kontrol) (■) infusi intralipid/heparin (intralipid) (□) Kandungan mRNA pada PDK4 Tidak ada perubahan signifikan yang tampak pada PDK1, PDK2, PDK3, atau PDP2 mRNA pada saat istirahat atau selama bergerak. Kandungan mRNA pada PDP1 Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Kandungan PDK dan PDP mRNA Perbedaan tingkat plasma FFA dan plasma insulin menyebabkan perbedaan pada ekspresi PDK4 mRNA. PDP1 mRNA mengalami penurunan regulasi pada rangka otot manusia selama bergerak, sementara PDP2 mRNA tidak dipengaruhi. Isoform PDKs dan PDPs mempunyai jaringan distribusi yang unik dan sensitifitas spesifik pada aktivator dan inhibitor. Ekspresi regulasi spesifik isoform PDK dan PDP merupakan perubahan penting pada fosforilasi PDH-E1α dan aktivitas PDH dan bisa menjadi target pada disregulasi PDH dalam diabetes tipe 2. FFAs yang bekerja mempunyai pengaruh pada ekspresi gen PDK4 dalam rangka otot manusia yang istirahat. Infusi insulin menyebabkan penurunan ekspresi PDK4 mRNA. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

KESIMPULAN Gerakan yang dilakukan dan modifikasi infusi intralipid mengurangi fosforilasi PDH-E1α pada kedua sisi 1 dan 2 dalam rangka otot manusia. Ada hubungan terbalik antara fosforilasi PDH-E1α dan aktivitas PDHa dalam rangka otot manusia. Peningkatan plasma FFAs tidak merubah aktivitas PDHa, meskipun fosforilasi PDH-E1α meningkat. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

REFERENSI Frank, Rane A. W. The Molecular Origins of Specificity in the Assembly of a Multienzyme Complex. 2005. Elsevier. Holness, M. J, Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. 2003. Biochemical Society. Patel, M. S, Korotchkina, L. G. Regulation of the pyruvate dehydrogenase complex. 2006. Bochemical Society. Maret 2007 Metabolisme Biokimia

Terima Kasih Maret 2007 Metabolisme Biokimia