PEMERIKSAAN BAKTERI, KHAMIR DAN JAMJUR PREPARAT TETES GANTUNG Preparat tetes gantung atau preparat basah memungkinkan pemeriksaan organisme hidup yang tersuspensi dalam zat cair. Preparat basah diperoleh dengan menaruh setetes zat yang mengandung organisme pada kaca objek (object glass) dan menutupnya dengan kaca yang sangat tipis yang dinamakan kaca tutup (cover glass). Untuk mengurangi laju penguapan dan meniadakan aliran udara, tetesan itu biasanya dilingkari dengan “vaselin” sehingga antara objek gelas cekung dan cover glass tertutup rapat.

Keuntungan Penggunaan Metode Tetes Gantung 1 Keuntungan Penggunaan Metode Tetes Gantung 1. Bakteri yang ada dan hidup terkurung dalam lubang kaca (objek glass cekung) , sehingga bahaya terhamburnya bakteri hampir tidak ada 2. Bakteri dapat bergerak dengan leluasa , untuk mengamati motilitas dan reproduksi 3. Apabila morfologi mikroorganisme yang tengah diperiksa dapat rusak karena perlakuan dengan panas atau bahan kimia ataupun bila organisme tersebut sukar diwarnai

TEKNIK PEWARNAAN Pemeriksaan mikroorgansime secara mikroskopis dapat menggunakan teknik pewarnaan dengan senyawa organik berwarna. Prosedur pewarnaan digunakan untuk : 1. Mengamati morfologi mikroorganisme (bentuk, ukuran) 2. Mengidentifikasi bagian-bagian strutur sel mikroorganisme 3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa berdasarkan reaksi terhadap zat warna sehingga sifat fisik dan kimia yang ada dapat diketahu

Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuik pemeriksaan mikroskop adalah : 1. Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen, pada kaca objek 2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan mikroorganisme itu melekat pada kaca objek 3. Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana ) atau serangkaian larutan pewarna (pewarnaan differensial)

FAKTOR-FAKTOR PENENTU KEBERHASILAN PEWARNAAN 1. Fiksasi 2 FAKTOR-FAKTOR PENENTU KEBERHASILAN PEWARNAAN 1. Fiksasi 2. Peluntur warna (discoloring agent) 3. Substrat 4. Intensifikasi pewarnaan 5. Zat warna

TUJUAN FIKSASI a). Melekatkan sel pada kaca objek b) membunuh mikroba agar mudah diwarnai c) mencegah terjadinya otolisis sel d) merubah daya ikat zat warna

Pewarnaan differensial untuk membedakan golongan bakteri berdasarkan affinitas terhadap zat warna a. Pewarnaan Gram b. Pewarnaan Tahan Asam (TA): Ziehl Neelsen c. Pewarnaan struktur sel : Capsul, Spora, Flagella d. Pewarnaan negatif

Persiapan Preparat Untuk pemeriksaan Bakteri Teknik Pemeriksaan Persiapan Penerapan A. Tetes Gantung Tetesan zat alir berisikan organisme pada kaca objek atau kaca penutup Telaah morfologi, struktur sel internal, motilitas atau perubahan sel B. Prosedur pewarnaan Pewarnaan sederha Pewarnaan differensial a. P Gram Suspensi sel difiksasikan pada kaca objek Olesan diwarnai dengan larutan zat pewarna tunggal Dua atau lebih reagen digunakan dalam proses pewarnaan Pewarna tunggal (ungu kristal) diterapkan pada olesan, kemudian diperlakukan dengan reagen dan diberi pewarna tandingan yaitu fuchsin Berbagai prosedur pewarnaan Menunjukkan ukuran, bentuk dan tata letak sel Dapat mengamati perbedaan antara sel =sel dan bagian-bagian sel Mencirikan bakteri menjadi salah satu diantara dua kelompok Gram Positif-ungu gelap Gram Negatif-merah

Persiapan Preparat Untuk pemeriksaan Bakteri Teknik Pemeriksaan Persiapan Penerapan b. Tahan Asam c. Spora d. Kapsul Olesan diwarnai dengan karbolfuksin, dipucatkan dan diberi pewarna tandingan biru methilen Pewarna utama (Carbol fuchsin) diterapkan dengan panas agar merembes kedalam spora, sel-sel vegetatif terwarnai oleh pewarna tandingan yaitu biru methilen Olesan terwarnai setelah perlakuan dengan tinta cina dan fuchsin Memisahkan bakteri Tahan Asam yang tidak hilang warnanya bila dikenai larutan asam (Mikobakterium), dari bakteri tak tahan asam yang pudar warnanya karena asam Endospora dapat dilihat pada spesies Bacillus dan Clostridium Kapsul dapat dilihat sebagai zone bening mengelilingi sel bakteri berkapsul

METODE UNTUK MENGUKUR PERTUMBUHAN BAKTERI Beberapa Penerapan Hitungan Mikroskopik (Penggunaan ruang hitung) Hitungan Cawan (teknik pengenceran) Membrab atau filter molekuler Pengukuran kekeruhan (Turbidometer) Penghitungan bakteri dalam susu dan vaksin Penghitungan bakteri dalam susu, air, makanan, tanah, biakan dsb Sama seperti hitungan cawan Uji Mikrobiologis, pendugaan hasil panen sel dalam kaldu biakan atau suspensi cair

PEWARNAAN GRAM Larutan dan Urutan Penggunaannya Reaksi dan Penampilan bakteri Gram Positif Gram Negatif Kristal violet (KV) Larutan yodium (Lugol) Alkohol 4. Air Fuchsin Sel berwarna ungu Kompleks KV-Y terbentuk di dalam sel, sel tetap berwarna ungu Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membrane menuru , KV-Y tidak dapat keluar dari sel, sel tetap ungu. Sel tidak terpengaruh, tetap berwarna ungu Lipid terekstraksi dari dinding sel, pori=pori mengembang , kompleks KV-Y keluar dari sel, sel menjadi tidak berwarna Sel menyerap zat pewarna air fuchsin menjadi berwarna merah

PEWARNAAN GRAM (Christian Gram 1884) Gentiana violet Lugol Alkohol 96% Saffranin /air fuchsin GRAM (+) -Mengandung Mg. Ribonucleate -Sangat sensitif terhadap Tryphenyl Methane -Sensitif terhadap penicillin -Tahan basa, tidak larut dengan 1% KOH -Isoelektrik range pH 2,5 – 4 - Biasanya cocci, kecuali gonococcus -Batang pembentuk spora kecuali Lactobacillus, Corynebacterium -Bisa tahan asam

GRAM (-) - Tidak mengandung Mg GRAM (-) - Tidak mengandung Mg. Ribonucleate - Kurang sensitif terhadap Tryphenyl Methane -Sensitif terhadap Streptomycin -Sensitif basa, larut dengan 1% KOH -Isoelektrik range 4,5 – 5,5 -Bukan pembentuk spora -Tidak tahan asam