Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya Pengantar PEWARNAAN IMUN0KIMIA “IMMUNOSTAINING” DWI WINARNI Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya

A. Definisi visualisasi bagian jaringan atau sel melalui deteksi interaksi antibodi-antigen spesifik, dimana antibodi dilabel dengan label atau marker Beragam mulai wujud sel atau irisan beku hingga sel atau jaringan dalam blok parafin atau resin - Pewarna fluorensens koloid logam hapten marker radioaktif enzim

antigen dalam jaringan dalam immunostaining, antibodi digunakan untuk membentuk link antigen yang ada pada sel atau jaringan secara spesifik pada pewarna (reaksi yang menghasilkan warna) sehingga keberadaan antigen tersebut teramati di bawah mikroskop immunohistochemistry immunocytochemistry antigen dalam jaringan Antigen dalam kultur sel Cryostat section paraffin section resin section Memerlukan fiksasi Tanpa fiksasi

History of immunohistochemistry 1942 Coons, Creech, Jones, Berliner Developed indirect immunofluorescence method 1959 Singer Developed electron-dense molecular conjugate (ferritin) 1965 Sternberger Developed electron-opaque heavy metal technique (uranium) 1966 Graham & Karnovsky Developed enzyme tagging method (horseradish peroxidase 1967 Nakane & Pierce Developed enzyme-labelled antibody technique (immunoperoxidase) 1970 Developed unlabelled antibody method (PAP method) 1971 Faulk & Taylor Developed another electron-opaque heavy metal technique (colloidal gold) 1974 Heitzman & Richards Developed another unlabelled antibody method (ABC technique)

Prinsip imunohistokimia Reaksi antigen-antibodi untuk lokalisasi antigen Labeling dengan agen pewarna/fluoresens atau electron-opaque substance (ultrastructural tags) untuk memvisualisasi reaksi Ag-Ab

B. TAHAP-TAHAP DALAM IMUNOHISTOKIMIA B.1. ANTIGEN RETRIEVAL Antigen retrieval/unmasking  dengan melakukan pretreatment spesimen  Meningkatkan reaktivitas antigen dalam jaringan Mutlak dilakukan untuk jaringan yang difiksasi formalin karena fiksatif mengadakan cross link inter dan intramolekular dengan protein struktural tertentu yang dapat mengakibatkan masking antigen Pretreatment : digesti menggunakan enzim proteolitik, pemanasan, iradiasi microwave, autoclaving atau pressure cooking

B.1. 1. Digesti menggunakan enzim proteolitik B.1. ANTIGEN RETRIEVAL B.1. 1. Digesti menggunakan enzim proteolitik Pronase 0,05% w/v Proteinase-K trypsin 0,05% w/v pepsin 0,05% !!!!!!!! Tidak semua antigen memerlukan digesti proteolitik karena enzim proteolitik dapat menghilangkan reaktivitas antigen tertentu, menimbulkan antigenic sites palsu , atau mengubah sifat serta merusak antigen

B.2. IMMUNOLABELING

Visualized antigen-antibody reaction by adding SUBSTRATE & CHROMOGENS

Sampel : pankreas rat (fiksatif formalin/PFA) Antigen retrieval : - Blocking : BSA 2%, 2 jam 25oC Primary antibody : mouse-anti –rat insulin Secondary Ab : goat-anti-mouse HRP conjugation Chromogen : DAB

substance P merupakan primary afferent derived neuropeptide   .substance P merupakan primary afferent derived neuropeptide .jumlah reseptor dan kadar substance P meningkat pada kondisi pain persistent (ex: inflamasi kronis)

CGRP (Calcitonin gene related peptide ) is one of the most abundant peptides produced in both peripheral and central neurons. It is the most potent peptide vasodilator and can function in the transmission of pain. In the trigeminal vascular system the cell bodies on the trigeminal ganglion are the main source of CGRP. CGRP is thought to play a role in cardiovascular homeostasis andnociception.

APOPTOTIC CELLS DETECTION