Ruletha D. Baker, Carma O. Cook, and Douglas C. Goodwin Catalase-Peroxidase Active Site Restructuring by a Distant and “Inactive” Domain Ruletha D. Baker, Carma O. Cook, and Douglas C. Goodwin Oleh : Tina Dewi Rosahdi (20506001) Rina Budi Satiyarti (20506005)

Katalase-Peroksidase (KatG) -Termasuk golongan enzim oksido reduktase -Dibentuk dari dua domain peroksidase, yaitu domain N- terminal (KatGN) dan domain C-terminal (KatGC) -Mempunyai satu sisi aktif multifungsional yang memfasilitasi aktivitas katalase dan peroksidase -Berperan dalam degradasi hidrogen peroksida (H2O2)

Siklus Katalitik Aktivitas katalase melibatkan siklus di antara resting dan pembentukan senyawa I Aktivitas peroksidase mencakup reaksi yang melibatkan pembentukan senyawa I dan senyawa II

Kemampuan Bifungsional Katalase-Peroksidase Enzim Heme dengan aktivitas katalase besar menunjukkan sedikit aktivitas katalase peroksidase, demikian juga sebaliknya. Struktural yang sama dari kedua enzim menyediakan sistem yang kuat untuk memisahkan gangguan kecil sisi aktif enzim heme yang berperan penting dalam perbedaan mekanisme dan fungsi.

Domain N-terminal (KatGN) Mengandung heme terikat Sisi aktif bifungsional Domain C-terminal (KatGC) Mengandung 300 asam amino Tidak mengikat heme Tidak mempunyai aktivitas katalitik Jika tidak ada, sisi aktif distal histidin bertindak sebagai ligan pada heme iron  menyebabkan kemampuan sisi aktif histidin sebagai basa terganggu

METODE Ekspresi dan pemurnian wtKatG (tipe alami KatG) Ekspresi dan pemurnian Domain KatG, KatGN, dan KatGC Pencampuran dan inkubasi domain Uji aktivitas katalase dan peroksidase Spektroskopi Ultra Violet dan sinar tampak (UV-Vis) Circular Dichroism Spectropolarimetry Spektroskopi Resonansi Paramagnetik Elektron

HASIL Far-UV Circular Dichroism Spectra a = KatGN b = KatGC c = wtKatG d = campuran equimolar abcKatGN dan KatGC

Dari hasil CD Spectra diperoleh : Persiapan pemisahan domain, KatGN dan KatGC, tidak dihasilkan pada gangguan mayor untuk isi struktur sekunder yang diharapkan untuk masing-masing domain dari enzim tipe alami Campuran fisika KatGN dan KatGC tidak dengan jelas merubah isi struktur sekunder setiap protein

Reaktivasi KatGN dengan adanya KatGC a. Aktivitas Katalase b. Aktivitas Peroksidase a = campuran equimolar KatGN dan KatGC b = KatGN c = KatGC d = campuran equimolar KatGN dan bovine serum albumin

Aktivasi Katalase dan Peroksidase berdasarkan Waktu Inkubasi pada Campuran Equimolar KatGN dan KatGC Kreact aktivasi Katalase = 3,4x10-3 min-1 Kreact aktivasi Peroksidase = 2,5x10-3 min-1

Pengaruh pH pada kreact dan Amplitudo KatGN yang Direaktivasi oleh KatGC kreact maksimum diperoleh pada pH 6, yaitu 9,4x10-3 min-1 Substitusi ke persamaan 1) untuk pH 8-6 menghasilkan pKa = 6,2 dan prediksi kreact maksimum = 1,4x10-2 min-1

Pengaruh Ekspresi dan Isolasi KatGC pada Spektrum Absorpsi Sinar Tampak EPR KatGN Solid line = KatGN Dashed line = campuran equimolar KatGN dan KatGC Bold line = campuran equimolar KatGN dan KatGC (diinkubasi selama 48 jam pada 4oC) Dotted line = wtKatG

Pengaruh Ekspresi dan Isolasi KatGC pada Spektrum EPR KatGN KatGC + KatGN (Penambahan equimolar) KatGC + KatGN (Inkubasi selama 48 jam pada T=4oC) Tipe alami KatG

Interfaces di antara domain N-terminal dan domain C-terminal KatG Intrasubunit domain C-terminal Intersubunit domain C-terminal domain N-terminal Heme Distal histidin

Kesimpulan Pentingnya domain C-terminal pada struktur katalase-peroksidase dan katalisis ditunjukkan oleh kemampuannya untuk mengembalikan domain N-terminal pada konformasi aktif bifungsionalnya. Domain C-terminal mengatur folding dan pemeliharaan sisi aktif bifungsional.

Terima Kasih