BIOASSAY GUIDED FRACTINATION DR. WARSINAH, M.SI., APT JURUSAN FARMASI FKIK

BIOASSAY GUIDED FRACTINATION PEMISAHAN (FRAKSINASI) UJI AKTIVITAS

EKSTRAKSI Tanaman basah Senyawa target td rusak karena panas Mudah Contoh: Enfloret .perendaman tanaman dengan minyak untuk diambil minyakya) Pengambilan minyak kemiri (dipres) Simplesia (tanaman kering) Maserasi (direndam dengan pelart dalam watu tertentu) Decocta (direndam pakai air panas) Perkolasi (dialiri pelarut dan ekstrak ditamung) Sohxletasi (dialiri pelarut yang dipanaskan terlebih dulu dan ekstrak ditampung pada labu tempat pelarut dipanaskan

Enfloret Tempat pemanas MINYAK kelapa Bahan pemanas

DIKERINGKAN DAN DISERBUK MASERASI DIKERINGKAN DAN DISERBUK ditimbang 2/3 1/3

DECOCTA AIR PANAS (MENDIDIH) 24 JAM

perkolasi

SOHXLETASI Tabung atas: pendingin spiral/liebig Tabung bawah: sampel Labu alas bulat: tempat pearut dan ekstrak Air masuk

fraksinasi Cair –cair> dengan corong pisah Padat cair > perendaman > kromatografi kolom > Kromatografi lapis Tipis > kromatografi kertas > HPLC (High Performan liquid chromatografi)

Cair- cair (corong pisah ) Pelarut yang digunakan tidak dapat campur dengan pelarut yang digunakan untuk mengekstrak contoh: pelarut utk mengekstrak etanol senyawa yang akan diambil asam lemak maka pelarut yang digunakan adalah pelarut non polar seperti n-heksan, kloroform, ether atau dietylether

Kromatografi lapis tipis UV 254 UV 366

Kromatografi kolom Tinggi tabung : 60 cm Tinggi silika: 2/3 tabung Garis tengah Tabung: 8,6,4,2 & 1 cm Pelarut: tunggal atau campuran ( non polar ke polar)

HASIL FRAKSI

UJI AKTIFITAS ANTI OKSIDAN : BHT ATAU DPPH ANTIINFLAMSI: OEDEN KAKI TIKUS ANTIBAKTERI: BAKTERI GRAM POSITIF ATAU GRAM NEGATIF ANTIJAMUR : JAMUR CANDIDA ALBICAN ASAM URAT: ASAM OSOLONAT ANTIKANKER: INVITRO- SEL, INVITRO: TIKUS ANTIDIABETUS MELITUS : TIKUS ANTI ASMA: OTOT POLOS USUS SAPI

Contoh bioassay guided fraktnation Pembuatan simplesia dan ekstrak Kulit batang B gymnorhiza Maserasi dengan metanol(3x24 jam) Diseleksi Dikeringkan Saring dan diuapkan simplisia Ditumbuk Ekstrak metnol serbuk

2. Fraksinasi fraksi metanol Fraksinasi degan n-heksan residu Fraksinasi dengan kloroform Fraksi larut n heksan residu Fraksinasi dengan Etilasetat Uapkan Fraksi larut kloroform residu Uji aktifitas Fraksi larut etil asetat Larut metanol

CARA KERJA 1. FRAKSINASI fraki kloroform DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM Fraksi kloroform F1 F2 F3 F4

2. Pembuatan larutan uji saring Fraksi aktif ditimbang Stoksampel dilarutkan 1,25% DMSO ditimbang Stoksampel 10 ug/ml Kadar 1 Kadar 2 kadar 3 kadar 4 kadar 5 18

3. Uji sitotoksik/ antiprolferatif Media sampel Sel Dokso rubisin Sel + sampel Sel+ doksorubisin Media+ sampel Media+ sel INKUBASI 24 jam Elisa reader MTT INKUBASI 4 JAM, 37C Absorban REAGEN STOPER INKUBASI SEMALAM 19

Contoh hasil uji aktifitas A. Ekstrak Metanol Kulit Batang B. gymnorhiza dan Aktivitas Sitotoksiknya Rendemen ekstrak metanol : 13,07%). ekstraksi pada tanaman Rhizopra mucronata menghasilkan ekstrak sebesar 9,71% (Diastuti, 2009), tanaman Avicinea oficinale sebesar 9,25% (Bayu, 2009) dan Ipomea pescaprae sebesar 7,58% (Handayani, 2008 IC50 sebesar 228,78 µg/ml

Morfologi sel HeLa Gambar 5. Efek ekstrak metanol terhadap perubahan morfologi sel HeLa . Pengamatan morfologi sel pada jam ke 24 dilakukan dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 200x : kontrol sel (a), kontrol DMSO (b), perlakuan ekstrak metanol 500 µg/ml (c), 250 µg/ml (d) 125 µg/ml (e) dan 62,5 µg/ml (f), menunjukkan sel mati, mengapung, keruh, dan berbentuk bulat, menunjukkan sel hidup melekat didasar dan berbentuk daun

B. Fraksinasi Ekstrak Metanol dan Aktivitas Sitotoksik Hasil partisi ekstrak metanol dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etil asetat Fraksi Warna Berat fraksi (gr) % rendemen n-heksan Kuning 4,7 2,35 Kloroform Merah ungu 38,6 19,30 etilasetat Kuning muda 3,2 1,60 Residu Coklat merah 153,5 76,75

Aktivitas sitotoksik Harga IC50 fraksi F1-F5 Efek fraksi n-heksan, kloroform, etil asetat dan residu terhadap viabilitas sel kanker HeLa dengan metode MTT

C. Fraksinasi Fraksi Kloroform dengan Kromatografi Cair Vakum Hasil Fraksinasi Fraksi Kloroform dengan Kromatografi Cair Vakum Fraksi Gabungan Eluat no Warna fraksi   Berat fraksi (gr) F1 F2 F3 F4 F5 1-12 13-17 18-25 26-30 31-32 Putih Ungu kemerahan Kuning Coklat tua 1,9 2,7 1,4 0,9 21,4

Rf 0,52 Coklat Rf 0.51 Profil komatogram KLT fraksi F1-F5. Fase diam silika Gel 60 GF254 dengan fase gerak kloroform : etil asetat (6:4) dan dideteksi dibawah sinar UV254

Uji aktivitas sitotoksik Harga IC50 fraksi F1-F5 Kurva efek perlakuan fraksi F1- F5 terhadap viabilitas sel HeLa. Sel kemudian diberi perlakuan fraksi F1-F5 dengan konsentrasi 500, 250, 125 dan 62,5 dan 31,25 µg/ml dan diinkubasi selama 24 jam. Profil viabilitas sel disajikan dari rata-rata ± Standart deviasi (SD) dari 3 perlakuan.

D. Fraksinasi Fraksi F2 dan Aktivitas Sitotoksik Hasil pemisahan fraksi F2 Fraksi gabungan No eluat Warna fraksi Berat fraksi (mg) S1 1-4 Kuning 54 S2 5-16 Putih 19,6 S3 17-22 Ungu 158 S4 23-37 19,3 S5 38-44 Kuning muda 224 S6 45-55 Hijau S7 56-69 Coklat 67 S8 70-73 87 S9 74-83 480

Profil kromatogram KLT fraksi gabungan (S1-S9), dibawah UV254 (a) dan UV366 (b)

Efek sitotoksik fraksi S1-S9 terhadap sel Hela dan Harga IC50 Efek fraksi S1 - S9 terhadap viabilitas sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 µg/ml. Profil viabilitas sel menunjukkan dose dependent Harga IC50 pada perlakuan fraksi S1- S9 terhadap sel HeLa

E. Fraksinasi Fraksi S3 dan Aktivitas Sitotoksik Fraksi gabungan dari hasil pemisahan fraksi S3 Fraksi gabungan No eluat Warna fraksi Berat fraksi (mg) T1 1-4 Kuning 12 T2 5-16 19 T3 17-22 18 T4 23-37 Ungu 48 T5 38-44 Kuning muda T6 45-55 Hijau 13 T7 56-69 Coklat 15 T8 70-73 T9 74-83

ungu coklat Profil kromatogram KLT fraksi gabungan T1- T9 dibawah UV254

Efek sitotoksik fraksi gabungan T1 - T9 terhadap viabilitas sel HeLa Nilai IC50 dalam µg/ml fraksi gabungan T1-T9 pada sel HeLa  

Fraksi No eluat Warna fraksi Berat fraksi (mg) I1 1-3 Kuning 1,9 I2 F. Fraksinasi Fraksi T4 dan Aktivitas Sitotoksik 1. Hasil pemisahan T4 Fraksi No eluat Warna fraksi Berat fraksi (mg) I1 1-3 Kuning 1,9 I2 4-7 Ungu 32 I3 8-9 Merah 2,34 2. Profil KLT I1, I2, dan I3 3. Aktivitas sitotoksik dilihat dari harga IC50 ungu No Nama isolate Harga IC50 (µg/ml)   1 Isolat 1 (I1) 11,66 2 Isolat 2 (I2) 4.72 3 Isolat 3 (I3) 24,72

Efek isolat terhadap viabilitas sel Hela Efek isolat I1 Efek isolat I2 Efek isolat terhadap viabilitas sel Hela Efek isolat I3

G. Pemurnian Fraksi I2 Isolat Warna isolat Berat isolat (mg) Isolat 1 Hasil pemurnian fraksi I2 menggunakan fase diam sephadex LH 20 dan fase gerak metanol Isolat Warna isolat Berat isolat (mg) Isolat 1 Kuning 2, 7 Isolat 2 Merah 1,4 Isolat 3 Ungu 29 Uji kemurnian dengan KLT Harga Rf isolat aktif pada fase diam silika gel GF254 dengan tiga fase gerak yang berbeda polaritasnya No Fase gerak Harga Rf 1 kloroform:etilasetat (6:4) 0.69 2 n-heksan: etilasetat (3:7) 0,59 3 n heksan: metanol (5:5) 0,35 Kromatogram KLT isolat aktif yang telah dimurnikan. (a) fase gerak kloroform:etilasetat (6:4), (b) fase gerak n-heksan: etilasetat (3:7), (c) fase gerak n heksan: metanol (5:5)

H. Aktivitas Biologis Isolat Aktif 1. Efek sitotoksik IC 50 = 4,13 µg/ml Efek isolat aktif terhadap viabilitas sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan 10, 5, 2.5, 1.25 dan 0.63 µg/ml

2. Efek antiproliferatif isolat aktif terhadap sel HeLa Efek antiproliferatif isolat pada berbagai konsentrasi terhadap sel HeLa pada berbagai waktu. - Inkubasi 3x103 sel HeLa selama 24 jam. Waktu penamatan 0, 24, 28 dan 72 jam Konsentrasi isolat maupun doxorubibicin uang dignakan 1, 2 dan 4 µg/ml)

3. Pengaruh isolat terhadap siklus sel Hasil analisis siklus sel HeLa dengan perlakuan isolat (2 µg/ml) dan doxorubicin (2 µg/ml) pada pengamatan 24 jam dibanding sel kontrol Pengamatan siklus sel HeLa dengan flow cytometri setelah inkubasi 24 jam Perlakuan M5 M1 M2 M3 M4   subG1 G1 S G2-M Hiperploidi Kontrol 4,58 56,12 12,81 14,91 11.92 Doxorubicin 26.16 35.61 9,50 16.79 12,67 Isolat 26.82 31.4 10,10 24,41 17.27

4. Aktivitas Isolat pada Induksi Apoptosis sel HeLa a. Metode double staining sel Hela terlihat berwarna orange dengan bentuk yang tidak teratur yang mengindikasikan sel mengalami apoptosis Sel hidup berwarna hijau terang berbentuk daun kontrol Perlakuan isolat aktif Hasil pengamatan morfologi sel Hela dengan pengecatan DNA menggunakan akridine orange – etidium bromide

Hasil analisis induksi apoptosis dengan Flowcytometri b. Induksi apoptosis dengan metode Flowcytometri Pengamatan induksi apoptosis sel HeLa menggunakan metode Flowcytometri. Kontrol (A), perlakuan doxorubicin 2 µg/mL (B) dan perlakuan isolat aktif 2,16 µg/mL (C). (Sh) sel hidup, (an) sel mati nekrosis, (ap) sel mati secara apoptosis Hasil analisis induksi apoptosis dengan Flowcytometri Jenis sampel % hidup % apoptosis % nekrosis Kontrol 61,57 17, 90 18,02 Doxorubicin 1,55 68.12 26,77 Isolat 46,77 23,26 18,59

Perlakuan doxorubicin 5. Pengamatan ekspresi protein a. Ekspresi P53 Kontrol sel Perlakuan doxorubicin Perlakuan isolat Efek perlakuan isolat aktif terhadap ekspresi p53 pada sel HeLa. Sel Hela ditanam sebanyak 5x104 sel/sumuran pada coverslips dalam plate 24. Selanjutnya diberi perlakuan isolat aktif maupun doxorubicin.