Protein Engineering: Site-Directed Mutagenesis dan Directed Evolution Dessy Natalia Departemen Kimia dan KPP Bioteknologi Institut Teknologi Bandung

Keanekaragaman Protein Keanekaragaman hayati Rekayasa Protein In silico

Rational Protein Design Perubahan asam amino/urutan spesifik Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi Memerlukan informasi struktur protein dan ‘intuisi’

Efficient & Rational Protein Design Interdisiplin Gen berada dalam vektor ekspresi yang baik Struktur 3-D protein Computer modelling Struktur 3-D protein homolog, jika tidak ada informasi struktur Informasi struktur-fungsi dari protein homolog/related

Siklus Protein Design Penapisan, pemurnian dan karakterisasi protein baru. Penentuan ukuran, sifat katalisis dan stabilitas (untuk perencanaan dan evaluasi varian) Kloning dan ekspresi protein WT Kristalisasi dan elusidasi struktur Computer modelling untuk menentukan struktur 3-D WT Komputer modelling untuk menentukan residu yang akan dirubah Site-directed mutagenesis dan evaluasi varian protein Rekristalisasi dan penentuan struktur varian protein Remodelling untuk perbaikan lebih lanjut

Konsep Dasar Struktur Protein Framework: mengandung ikatan hidrogen struktur sekunder Loops: menghubungkan struktur sekunder Exterior: bagian protein yang berkontak langsung dengan solvent Interior: bagian yang tidak berkontak langsung dengan solvent Core: daerah yang paling lestari pada sekuens dan struktur Variable: daerah yang mempunyai konformasi fleksibel dan sekuens bervariasi

Mutasi Loop: dapat diterima, tidak mengalami perubahan utama pada struktur, tetapi dapat mempengaruhi fungsi Exterior: Dapat berkontak dengan molekul solvent. Sifat solvasi, kecendrungan membentuk agregat protein-protein, biasanya tergantung pada residu dipermukaan. Biasanya tidak merubah 3-D secara signifikans. Core: perubahan residu non-polar dengan yang lain tidak mempengaruhi struktur secara signifikans. Perubahan menjadi residu polar, bermuatan pada core hidrofobik dapat mereduksi stabilitas keadaan native dan merubah konformasi protein

Perbaikan Stabilitas Protein Pembentukan interaksi polar dan elektrostatik pada bagian interior core: stabilisasi ikatan hidrogen internal, jembatan garam Peningkatan interaksi hidrofobik pada interior core Penurunan entropi konformasi unfolding melalui perubahan residu fleksibel Gly, Ser, Ala menjadi residu rigid Thr, Val, Pro Cross-linking melalui ikatan disulfida pada permukaan protein Mengganti asam amino yang dapat teroksidasi (Cys, Met, Asn, Gln) menjadi yang tidak dapat teroksidasi Ser, Ala

Pembuatan Mutan Directed Random Recombination

Directed rational (site directed mutagenesis) G TAC GGC CCG TAA A C CGC ATC TTT AAA AAA AAT ATG CCC GGC ATT TTG GCG TAG AAA TTT TTT TTA

Hyperthermostabilization:His133Ile, Ala209Val, His156Tyr, Asn172Arg, Ala181Thr, Asn190Phe, Asn265Tyr, Gln264Ser, Asn265Tyr Destabilization: Asp204Lys, Lys237Asp

Random: Error prone PCR Kesalahan pada saat polimerisasi oleh DNA polimerase Penurunan fidelitas DNA polimerase oleh ion Mn2+ Penurunan konsentrasi nukleotida Peningkatan siklus PCR Terbatas pada fragmen berukuran kecil ( <800pb) “asexual PCR”

Recombination: DNA shuffling Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994 370, 389-91 “sexual PCR” Pencampuran materi genetik dari induk yang berbeda DNA induk dipotong dengan DNaseI Fragmen acak mengalami proses denaturasi, annealing, dan perpanjangan yang dikatalisis oleh DNA polimerase

Recombination DNA shuffling Wt gene Error prone PCR or other method DNase I fragmentation

Recombination Family shuffling Extention of technique to homologous genes Need >60% similarity 1. Fragment 2. Reassemble

DNA Shuffling

α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens Temperatur optimum 50oC-70oC pH optimum 6 Likuifasi pati dan detergen Site directed mutagenesis: BAA S201N (pada pH 10 aktivitas meningkat 16%; pada pH 10 aktivitas meningkat 50%) dan BAA N297D (pada pH 10 aktivitas sama dengan WT; pada pH 11 aktivitas meningkat 50%) Error prone PCR: 7200 klon – 16 mutant DNA shuffling: 10.000 klon: 960 klon positif berdasarkan uji staining. Penapisan ulang: BAA42 (pH optimum 7, aktif pada daerah pH yang lebih luas, aktivitas meningkat 5 x pada pH 10) dan BAA 29 (profil pH sama dengan WT, aktivitas spesifik meningkat 9 x)