Microbial Biotechnology BIO--512 (ATW)

Presentasi berjudul: "Microbial Biotechnology BIO--512 (ATW)"— Transcript presentasi:

1 Microbial Biotechnology BIO--512 (ATW)
9/21/2010 Microbial Biotechnology BIO--512 (ATW) • Plant Growth Promoting Rhizobacteria o Symbiotic PGPR (Rhizobia) o Non--symbiotic PGPR • Microbial Insecticide (Bt) • Genetic Engineering of Plant • Therapeutic Agent and Vaccin • Molecular Diagnosis • Large Scale of Mass Production Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR): Rhizobia Dr. Aris Tri Wahyudi Department of Biology FMIPA Bogor Agricultural University 1

2 Biological N2-Fixation
9/21/2010 Biological N2-Fixation ~Approximately 80 % is free N2 ~It can not be used by microbes, directly ~It must be converted to N2-fixed: Nitrogen Fixation ~Microbe : Symbiotic; Non-Symbiotic ~Enzyme: Nitrogenase ~Biofertilizer 2 N Fixation Non-Symbiotic Cell Activity Air Symbiotic To Plant Carbohydrate 2

3 Root Nodule Bacterium : N2 Fixation
9/21/2010 Root Nodule Bacterium : N2 Fixation 3

4 Nitrogen Fixation 9/21/2010 Nitrogenase 2. Bradyrhizobium 3. Rhizobium
N2+8H++8e-+16MgATP 2NH3+H2+16 MgADP+16Pi Nitrogenase Symbiotic: Bradyrhizobium, Rhizobium, Azorhizobium, etc Non-symbiotic: Azospirillum, Azotobacter, etc Bakteri Penambat N2 Simbiotik: Membentuk Bintil (Nodul) 1. Azorhizobium 2. Bradyrhizobium 3. Rhizobium Azorhizobium : Membentuk bintil akar & batang Nodul Batang : Sesbania rostrata RHIZOBIA 4

5 9/21/2010 Metabolisme dan Translokasi Hasil fiksasi N2 yaitu NH3, diekskresikan sel Rhizobium atau Bradyrhizobium NH3 dlm bintil diproses menjadi : masuk ke bintil (nodul) Temperate Tropik glutamin % % Asparagin % % ureide Asam amino 8% % ditranslokasikan ke tanaman bagian atas lewat xylem. Bakteri bintil akar memperoleh sumber energi (karbohidrat) dari hasil fotosintesis tanaman (fotosintat) dari tanaman bagian atas ke akar lewat phloem. Sesbania rostrata 5

6 Bradyrhizobium japonicum
9/21/2010 Rhizobium Tumbuh cepat (3-5 hari) diatas YMA, 2-4 mm diameter Menghasilkan asam DNA : 59-64% G+C Membentuk bintil pada pepolongan subtropis Waktu generasi ~ 4 jam Bradyrhizobium Tumbuh lambat (5-7 hari) di atas YMA, diameter < sama dgn 1 mm Menghasilkan basa DNA : 61-65% G+C Membentuk bintil pada pepolongan tropis Waktu generasi ~ > 8jam Bradyrhizobium japonicum Bakteri bintil akar kedelai Gram negatif Fiksasi N2 molekular Tumbuh lambat Galur potensial : inokulan 6

7 Bradyrhizobium japonicum Strains
9/21/2010 Bradyrhizobium japonicum Strains Fig. Root Nodule Formation of Siratro by Bradyrhizobium japonicum 7

8 Fig. Physical map of the complete sequence of
9/21/2010 Fig. Physical map of the complete sequence of Bradyrhizobium japonicum USDA110 8

9 B. japonicum : nif H terpisah dari nif DK+ 17 kb
9/21/2010 Fiksasi Nitrogen (N2) Nitrogenase: 1. Komponen I : Mo-Fe-protein = dinitrogenase 2. Komponen II : Fe-protein = dinitrogenase reduktase Nitrogenase dikontrol oleh gen nif K. pneumoniae : > 20 gen nif teridentifikasi Gen-gen nif H D K nif H-----sintesis dinitrogenase reduktase nif D, nif K------sintesis dinitrogenase Nitrogenase sensitif terhadap oksigen (O2) Bakteri aerob : punya mekanisme khusus untuk mem- pertahankan O2 intraseluler tetap rendah Bakteri anaerobik fakultatif : Fiksasi N2 pada ada O2 atau tanpa O2 Bakteri anaerob : tanpa O2 Gen-gen nif pertama kali dipelajari pada K. pneumoniae ~dekat dengan E. coli ~model yang paling baik Fe-protein : terdiri dari 2 unit (dimer) disandikan oleh gen nifH 60 kDa Mo-Fe protein : tdr 4 subunit (tetradimer) : nifDK Gen-gen nif terletak pada plasmid (Rhizobium) dan pada kromosom (Bradyrhizobium) Penyusunan gen-gen nif sangat bervariasi : R. meliloti : nif HDK berdampingan B. japonicum : nif H terpisah dari nif DK+ 17 kb nif E, N, S, B terletak diantaranya K. pneumoniae: nif HDK berdampingan Ekspresi gen nif dipengaruhi oleh faktor lingkungan: NH3 dan O2 berlebih menghambat aktivitas nitrogenase 9

10 9/21/2010 ? Cluster II Struktur Gen Simbiotik pada
Bradyrhizobium japonicum nodVW nifDKE N X nifS nifB fixA nifH fixBCX Nod-2 ? Cluster I 70 kb Lokus III II I nolA nodD D1 nodYABCSUIJ Orf123 nodZ fixR nifA fixA Cluster II Biological Nitrogen Fixation : Klebsiella pneunoniae 10

11 9/21/2010 Two protein components: nitrogenase reductase
Klebsiella pneumoniae Nitrogenase Complex Two protein components: nitrogenase reductase and nitrogenase  Nitrogenase reductase is a 60 kDa homodimer with a single 4Fe--4S cluster Very oxygen--sensitive Binds MgATP 4ATP required per pair of electrons transferred Reduction of N2 to 2NH3 + H2 requires 4 pairs of electrons, so 16 ATP are consumed per N2 11

12 Why should nitrogenase need ATP?
9/21/2010 Why should nitrogenase need ATP?  N2 reduction to ammonia is thermodyna- mically favorable However, the activation barrier for breaking the N--N triple bond is enormous 16 ATP provide the needed activation energy Nitrogenase Function 12

13 9/21/2010 Species function B. sp (Parasponia) Species Function Gene
Gen-gen simbiotik pada Bradyrhizobium Gene nifA nifH nifDK nifB nifE Species B. japonicum B. sp (Parasponia) B. sp (cowpea) function transcriptional regulator of nif & fix expression structural gene for dinitro- genase reductase structural genes for dinitro- genase Fe MoCo synthesis B. sp (Parasponia) Gen-gen simbiotik pada Bradyrhizobium (Lanjutan) Gen nifN nifS fixA fixBC fixIJ fixR Species B. japonicum B. sp (Parasponia) Function Fe Moco synthesis Maturation of nitrogenase Electron transport to nitrogenase Sequence similarity to family of two-component regulatory proteins Function unknown : sequence similarity to dehydrogenases 13

14 9/21/2010 Hydrogen Uptake Penambatan N2 NH3, selalu dibebaskan H2 Gen hup + (hidrogen uptake) menyandikan : hidrogenase, meningkatkan fiksasi N2 simbiotik Beberapa Alasan : 1. Oksidasi H2, memungkinkan pengambilan kembali ATP yang digunakan oleh nitrogenase 2. Oksidasi H2 mengurangi resiko penghambatan nitrogenase oleh H2 3. Penggunaan O2 untuk mengoksidasi H2 dapat melindungi nitrogenase terhadap O2. nitrogenase sensitif thd O2. 14

15 Bradyrhizobium japonicum: hup+ and hup-
9/21/2010 Hidrogenase ATP Generation ATP ADP Energi Electron Carrier Komplek Nitrogenase N2 H+ H2 2NH3 Bradyrhizobium japonicum: hup+ and hup- Rhizobium leguminosarum 15

16 Nodulation A. Tahap-tahap pembentukan bintil akar
9/21/2010 Nodulation A. Tahap-tahap pembentukan bintil akar 1. Pengenalan thd pasangan yg benar pd tanaman dan pelekatan bakteri ke rambut akar 2. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri melalui pembentukan benang infeksi (infection threat) 3. Perjalanan bakteri ke akar utama lewat benang infeksi 4. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman 5. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, meng- hasilkan bintil akar dewasa Akar tanaman pepolongan mengeluarkan bahan organik untuk menarik mikroorganisme di sekitar perakaran (termasuk BBA) Pelekatan BBA dgn akar pepolongan tergantung dari makromolekul pd permukaan rambut akar yg berinteraksi dgn polisakarida BBA makromolekul : lektin polisakarida : 2-deoksiglukosa (R. trifolii) Rambut akar selanjutnya melengkung, lalu bakteri masuk membentuk benang infeksi. Sel-sel akar yg berdekatan menjadi terinfeksi BBA Sel yg terinfeksi, terangsang membelah (Sitokinin). Bakteri dlm sel tanaman membelah, berganda, menggembung mem- bentuk sel yg tdk beraturan dan bercabang : bakteroid Dikelilingi membran sel tanaman (peribacteroid membrane) fiksasi nitrogen mulai terjadi 16

17 Root Nodule Formation 1. Pengenalan thd pasangan dan pelekatan
9/21/2010 Root Nodule Formation 1. Pengenalan thd pasangan dan pelekatan bakteri ke rambut akar 2. Ekskresi nod faktor yang menyebabkan pelengkungan rambut-rambut akar 3. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri dan pembentukan benang infeksi (infection threat) 4. Perjalanan bakteri ke akar utama 5. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman 6. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, menghasilkan bintil akar dewasa 17

18 9/21/2010 Nodulation Dinodulasi B. Pembentukan bintil akar : nodulasi
Tanaman Pea Bean Clover Alfalfa Soybean Siratro Lupinus Parasponia Dinodulasi R. leguminosarum R. phaseoli R. trifolii R. meliloti B. japonicum B. lupini B. parasponiae Kec Tumbuh cepat lambat B. Pembentukan bintil akar : nodulasi 1. Sintesis polisakarida - B-1,2 glukan EPS proses infeksi - Eksopolisakarida (EPS) perkembangan nodul - Lipopolisakarida (LPS) pembentukan nodul Mempunyai peranan penting utk nodulasi R. meliloti mutan (B-1,2 glukan) dpt membentuk bintil tapi tdk berisi bakteri (pseudonodul) -Mutan Rhizobium EPS : tidak mampu membentuk nodul Mampu membentuk nodul, tapi tdk mampu menambat N2 -Efek mutasi, bergantung pada inang -R. leguminosarum bv. phaseoli (EPS) : bintil normal -R. leguminosarum bv. viciae (EPS) : tdk membentuk bintil -Mutan R. leguminosarum bv. phaseoli (LPS) : mampu membentuk bintil akar, tapi tdk menambat N2 18

19 9/21/2010 Species Gene B. japonicum function
2. Gen-gen untuk nodulasi (nod) -Banyak dipelajari pd R. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. viciae -Pada plasmid pSym : gen-gen nod berada pd fragmen 20 kb Transfer pSym ke spesies lain (resipien), resipien mampu membentuk bintil penambat N2 -Transfer pSym ke Agrobacterium menyebabkan nodul abnormal, fix -Plasmid pSym pRL1JI dari R. leguminosarum bv. viciae -Dua kelompok gen nod : nod ABCIJ : nod umum nod EFGH : penentu spektrum inang nod D : nod regulator = juga penentu inang Gen-gen Nodulasi pada Bradyrhizobium Gene nodABC nodD1 nodD2 nodI nodJ nodK Species B. japonicum B. sp (Parasponia) B. sp. (Parasponia) function Synthesis of essential factor for hair curling & cell div. Positive transcriptional re- gulation for gene expression Unknown function: mutation caused nod- Unknown function: ATP de- pendent transport protein Unknown function: Mem- brane location Unknown function 19

20 9/21/2010 Species Function Gene B. sp (Parasponia)
Gen-gen Nodulasi pada Bradyrhizobium (Lanjutan) Gene nodLMN nodSU nodV nodW nodY nodZ Species B. sp (Parasponia) B. japonicum Function Host range determination Unknown function Transcriptional regulation Genotype specific noduation Struktur Gen-Gen Nodulasi R. leguminosarum 20

21 9/21/2010 Isoflavon Struktur Gen nod R. leguminosarum
Model for Regulation of B. japonicum Nodulation Genes nodA nodY nodD1 DNA nodD1-box nodY-box Isoflavon NodD1 Protein Struktur Gen nod R. leguminosarum bv. viciae Sym Plasmid pRL1JI Aktivasi nodM nodL nodE nodF nodD nodA nodB nodC nodI nodJ Represi 21

22 3. Regulasi ekspresi gen nod a. R. leguminosarum bv. viciae
9/21/2010 3. Regulasi ekspresi gen nod a. R. leguminosarum bv. viciae nod ABCIJ, nod FE, dan nod D ditumbuhkan pada media penumbuhan yang normal hanya nod D yg ditranskripsi Jika eksudat akar (pea) ditambahkan pd media, nodFE dan nod ABCIJ aktif terekspresi, berarti eksudat akar tanaman inang dan gen nod D diperlukan untuk mengaktivasi operon nod. b. Flavonoid merupakan suatu inducer Flavon luteolin, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti 7,4-dihidroksi flavon, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti flavon dan flavanon mengaktivasi gen nod R. leguminosarum bv. viciae. 22

23 Aplikasi Bioteknologi
9/21/2010 Aplikasi Bioteknologi Biofertilizer Produksi inokulan untuk Tanaman Legum Inokulan pada Tanah Marginal Bioremediasi: Bioakumulasi Logam Berat 23