Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Nitrate Reductase (NADH) EC 1.7.1.1 Oleh: Dita Ayu Pratiwi (10506054) Sofi Siti Shofiyah (10506063) PRESENTASI ENZIMOLOGI KI- 5162.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Nitrate Reductase (NADH) EC 1.7.1.1 Oleh: Dita Ayu Pratiwi (10506054) Sofi Siti Shofiyah (10506063) PRESENTASI ENZIMOLOGI KI- 5162."— Transcript presentasi:

1 Nitrate Reductase (NADH) EC Oleh: Dita Ayu Pratiwi ( ) Sofi Siti Shofiyah ( ) PRESENTASI ENZIMOLOGI KI- 5162

2 Agenda Presentasi Tata nama enzim Kofaktor Mekanisme katalisis Manfaat enzim Struktur enzim Tahap isolasi dan pemurnian enzim Aplikasi Industri

3 IUBMB Enzyme Nomenclature EC Sumber : Springer Handbook of Enzymes

4 Kofaktor Nitrate Reductase (NR)

5 Mekanisme Katalisis NR Sumber: Fischer, et. al The Plant Cell.

6 Cleland Plot NR Sumber: Howard, et. al Journal Biological Chemistry

7 Asimilasi Nitrogen

8 Stuktur 3D NR Sumber: Fischer, et. al The Plant Cell

9 Sisi Aktif Enzim dan Muatan Permukaan NR Sumber: Fischer, et. al The Plant Cell

10 Arabidopsis thaliana Tanaman berbunga kecil yang hidup di dataran eropa, asia, barat laut afrika Tumbuh di musim semi Mempunyai siklus hidup yang relatif singkat Populer sebagai model organisme untuk memahami biologi molekul banyak tanaman

11 Produksi Rekombinan NR NR diekspresikan Diekspresikan di methylaptrophic yeast Pickia pastoris strain GS115 dari Arabdopsisi NIA NR cDNA pAtc-4 Pertumbuhan kultur Di kultur 500mL yang mengandung UPD media (1% yeast ekstrak, 2%peptone, dan 2% Glc, a11 w/v) Induksi ekspresi NR Sel log phase dicuci dan diresuspensi ke dalam 1L media MM yang dimodifikasi (2,8% [w/v yeast basa nitrogen dengan ammonium sulfate, 100mM potassium phosphate, pH 6, 4x % biotin, 0,2 mM Na-Molibdat, 1% metanol Sumber: Wenpei Su, et. al Plan Physiology.

12 Produksi Rekombinan NR (Lanjt) Kultur sel Ditambahkan methanol 1% (v/v) dan Na-Mo (0,2 mM) setiap 24 jam Setelah 72 jam periode induksi cel dikumpulkan, disentrifuga dan diresuspensi kembali, Diresuspensi Extraction buffer mengandung 50mM sodium phospate, pH 7,3, 1 mM EDTA, dan 5% (v/v) gliserol. Sel dipecahkan dengan Bead Beater menggunakan 0,5-pm glass beads selama 5 menit Ekstrak kasar Disentrifuga pada g selama 20 menit pada 4 o C Diuji aktifitas ekstrak kasar dan dimurnikan Sumber: Wenpei Su, et. al Plan Physiology.

13 Permunian NR Ekstrak kasar Pengendapan 30-45% amonium sulfat Pelet dilarutkan padan 50mM Natrium fosfat, ph 7,3, dan 1mM EDTA (bufferA) dialirkan ke Blue-Sepharose Blue Sepharose yang berikatan dengan NR dikumpulkan dengan filtrasi vakum yang dicuci dengan kolom 1,5 cm Kolom kromatografi Dielusi dengan 0,1 mM NADH dalam buffer A Sumber: Wenpei Su, et. al Plan Physiology.

14 Pemurnian NR (Lanjt) Fraksi NR Dipekatkan dengan 25mM Mops (ultrapure grade, Calbiochem), pH 7,0 menggunakan Centriprep 30 concetrator Sampe setengah murni Dialirkan ke 1,5 mL kolum 5’-AMP sepharose Kolum dicuci dengan buffer B ( 50mM Mops, pH 7, dan 1 mM EDTA. Dielusi dengan 0,1 mM NADH dalam Buffer B. Fraksi NR Yang mengandung aktifitas 2 unit/mL disatukan dan dikonsetrasikan dengan pertukaran buffer 25 mM Mops, pH 7,0 Sumber: Wenpei Su, et. al Plan Physiology.

15 Pengujian Kinetik NR Sampel NR murni Eksperimen dilakukan pada 25 o C dalam 1 mL buffer yang mengandung 50 mM Mops, pH 7,0 dengan pengukuran A340 dengan kuvet 1 cm dan UV /Vis Spektrofotometry Konsterasi Subtrat Divariasikan dari 0,5-20 μM untuk NADH dan 2,5-60 μM untuk KNO3 Analisis Kecepatan awal reaksi dianalisis dengan Enzpack software Spektrum dari oksidasi sampel dan NADH(red) ditentukan pada 25oC menggunakan UV/Vis dioda array spectofotometer Sumber: Wenpei Su, et. al Plan Physiology.

16 Aplikasi NR di Industri NR memiliki peran penting dalam bioteknologi lingkungan. Digunakan sebagai metode pengujian komersial kandungan nitrat dalam air (detektor elektronik berbasiskan enzim yang akan memonitoring secara kontinu kandungan nitrate dalam air) Pengujian reduks nitrate

17 Referensi Wenpei Su, Jeffrey A. Mertens, Kengo Kanamaru, Wilbur H. Campbell, and Nigel M. Crawford Analysis of Wild-Type and Mutant Plant Nitrate Reductase Expressed in the Methylotrophic Yeast Picha pastoris’. Plant Physiology. William D. Howard4 and Larry P. Solomonsonf Kinetic Mechanism of assimilatory NADH: Nitrate Reductase from Chlorella. Journal of Biological Chemistry Lawrie Skipper, Wilbur H. Campbell, Jeffrey A. Mertens, and David J. Lowe Pre-steady-state Kinetic Analysis of Recombinant Arabidopsis NADH:Nitrate Reductase. JBC Papers. Katrin Fischer, Guillaume G. Barbier, Hans-Juergen Hecht, Ralf R. Mendel, Wilbur H. Campbell, and Guenter Schwarza Structural Basis of Eukaryotic Nitrate Reduction: Crystal Structures of the Nitrate Reductase Active Site. The Plant Cell.

18 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung 2009


Download ppt "Nitrate Reductase (NADH) EC 1.7.1.1 Oleh: Dita Ayu Pratiwi (10506054) Sofi Siti Shofiyah (10506063) PRESENTASI ENZIMOLOGI KI- 5162."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google