Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Defosforilasi dan Aktivasi PDH-E1α pada Rangka Otot Manusia Selama Bergerak Pengaruh Infusi Intralipid Oleh: TINA DEWI ROSAHDI 20506001.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Defosforilasi dan Aktivasi PDH-E1α pada Rangka Otot Manusia Selama Bergerak Pengaruh Infusi Intralipid Oleh: TINA DEWI ROSAHDI 20506001."— Transcript presentasi:

1 Defosforilasi dan Aktivasi PDH-E1α pada Rangka Otot Manusia Selama Bergerak Pengaruh Infusi Intralipid Oleh: TINA DEWI ROSAHDI 20506001

2 Maret 2007Metabolisme Biokimia2 PDH-E1α Dephosphorylation and Activation in Human Skeletal Muscle During Exercise Effect of Intralipid Infusion Henriette Pilegaard, Jesper B. Birk, Massimo Sacchetti, Marina Mourtzakis, D. Graham Hardie, Greg Stewart, P. Darrell Neufer, Bengt Saltin, Gerrit van Hall, and F. P. Wojtaszewski AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, VOL. 55, NOVEMBER 2006

3 Maret 2007Metabolisme Biokimia3 PENDAHULUAN Keadaan fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan sisi 2 diharapkan menjadi sisi fosforilasi penting pada aktivitas PDHa dalam rangka otot. Asumsi : uji aktivitas in vitro mengukur aktivitas PDH dalam bentuk aktif mencerminkan keadaan fosforilasi dan bukan merupakan modifikasi kovalen. Diperlukan penjelasan peran sisi fosforilasi spesifik untuk aktivitas PDHa dan peran regulator PDH kinase/fosfatase.

4 Maret 2007Metabolisme Biokimia4 TUJUAN Menyelidiki fosforilasi subunit piruvat dehidrogenase (PDH)-E1α. Menyelidiki apakah asam lemak bebas (FFAs) meregulasi aktivitas PDH.

5 Maret 2007Metabolisme Biokimia5 Komplek Piruvat Dehidrogenase PDC merupakan komplek multienzim yang dilibatkan dalam dekarboksilasi piruvat, proses yang berhubungan dengan glikolisis dan TCA. EnzimLambangJumlahCopiGugus Prostetik Piruvat dehidrogenase E130TPP Dihidrolipoil transasetilase E230Lipoamid Dihidrolipoil dehidrogenase E312FAD Komponen PDC

6 Maret 2007Metabolisme Biokimia6 Komplek Piruvat Dehidrogenase

7 Maret 2007Metabolisme Biokimia7 Ikatan pada komponen PDC; PDH, E3, PDHKs (PDKs) dan PDPs

8 Maret 2007Metabolisme Biokimia8 PDH-E1α PDH E1 adalah heterotetramer subunit 2α dan 2β. Mengkatalisis dekarboksilasi piruvat. Distimulasi oleh insulin. Diinhibisi oleh ATP, NADH, dan asetil-CoA. Meregulasi aktivitas komplek PDC oleh fosforilasi-defosforilasi tiga residu serin spesifik pada subunit E1α.Meregulasi aktivitas komplek PDC

9 Maret 2007Metabolisme Biokimia9 Struktur PDH-E1

10 Maret 2007Metabolisme Biokimia10 Mekanisme regulasi aktivitas PDK dan PDP PDK dan PDP adalah regulator enzim yang mengkatalisis interkonversi PDC diantara bentuk aktifnya (defosforilasi) dan bentuk tidak aktif (fosforilasi). Keseimbangan siklus fosforilasi/defosforilasi ditentukan oleh aktivitas relatif PDK dan PDP.

11 Maret 2007Metabolisme Biokimia11 MODEL DAN METODE PENELITIAN Subyek Penelitian Parameter Darah Glikogen Otot Isolasi RNA, Transkripsi Balik, dan Kandungan cDNAIsolasi RNA Real-Time PCR Antibodi PDH Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1αKarakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α Preparasi Mitokondria Homogenat/Lisat Otot Manusia Aktivitas PDHa Statistik

12 Maret 2007Metabolisme Biokimia12 Subyek Penelitian Tujuh orang yang sehat - umur 25,4 ± 1,3 tahun - tinggi 181 ± 2 cm - berat 74 ± 3 kg) Diambil darahnya  biopsi otot  infusi intralipid dan kontrol - Contoh darah diambil sebelum infusi dan pada 60, 90, 120, 180, 210, dan 240 menit istirahat selama infusi dan setiap 30 menit selama 3 jam bergerak. - Biopsi otot diperoleh sebelum infusi dimulai, pada 4 jam istirahat dan setelah 45, 90, 135, dan 180 menit bergerak. 4 jam istirahat (terlentang), kemudian 3 jam menggerakkan lutut kedua kaki.

13 Maret 2007Metabolisme Biokimia13 Parameter Darah Konsentrasi plasma FFA ditentukan menggunakan kit Wako FA dan spektrofotometer otomatis. Konsentrasi plasma insulin ditentukan menggunakan insulin enzyme-linked immunosorbent assay kit.

14 Maret 2007Metabolisme Biokimia14 Glikogen Otot Sample otot beku Sample otot bebas darah, lemak, dan jaringan penghubung Unit glikosil  Dikeringkan ianalisis Dihidrolisis dengan asam menggunakan Spektrofotometer otomatis

15 Maret 2007Metabolisme Biokimia15 Isolasi RNA, Reverse Transcription, dan Kandungan cDNA Isolasi RNA:220 mg jaringan otot Total RNA Reverse Transcription: sistem Superskrip II RNase H - dan Oligo dT. Bisa dihitung jumlah single-stranded DNA jika ditambah Reagen OliGreen. Kandungan total cDNA: hasil normalisasi jumlah target cDNA. Diisolasi dengan metode ekstraksi guanidium tiosianat-fenol-kloroform

16 Maret 2007Metabolisme Biokimia16 Real-Time PCR Kandungan mRNA ditentukan dengan PCR menggunakan uji fluorogenik 5’ nuklease Tabel 1 Urutan primer dan probe TaqMan yang digunakan untuk real-time PCR

17 Maret 2007Metabolisme Biokimia17 Antibodi PDH Tiga poliklonal antibodi anti-PDH PDH BebasPDH yang dikenali Ser 293 (sisi 1) PDH yang dikenali Ser 300 (sisi 2)

18 Maret 2007Metabolisme Biokimia18 Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α 8 mg rangka otot tikus homogen, mitokondria, fraksi sitosolik (remnant) SDS-PAGE + Antibodi  Western blotting

19 Maret 2007Metabolisme Biokimia19 Homogenat rangka otot manusia, lisat, pellet Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α SDS-PAGE + Antibodi  Western blotting

20 Maret 2007Metabolisme Biokimia20 4 μg protein lisat otot Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α SDS-PAGE + Antibodi  Western blotting Uji spesifisitas antibodi  uji kompetisi peptida

21 Maret 2007Metabolisme Biokimia21 Sample otot Karakterisasi Antibodi Subunit PDH-E1α Otot 3 μg lisat dipotong Lisis +/- λ-P dan/atau PI SDS-PAGE, Western blotting

22 Maret 2007Metabolisme Biokimia22 Preparasi Mitokondria 250 g gastrocnemius otot tikus Suspensi Homogenat Diiris + KCl, Tris-HCl, basa-Tris, NaF, Na 3 VO 4, Na 4 P 2 O 7, EDTA, EGTA, Benzamidin Dirotasi, 15’ Homogenisasi dengan politron Supernatan Mitokondria (pellet) Kontrol sitosolik Suspensi + buffer Tris-EDTA + Inhibitor protease disentrifugasi

23 Maret 2007Metabolisme Biokimia23 Homogenat/Lisat Otot Manusia Sample otot beku Sample otot bebas darah, lemak, dan jaringan penghubung  Dikeringkan ianalisis Dihidrolisis dengan asam menggunakan Spektrofotometer otomatis Supernatan Pellet Diambil Didinginkan dalam nitrogen cair, disimpan pada -80 0 C

24 Maret 2007Metabolisme Biokimia24 Aktivitas PDHa 8-15 mg jaringan otot homogenat Dihomogenisasi pada es, 50’’ Menggunakan Homogenizer glass micro Ditentukan aktivitas PDHa

25 Maret 2007Metabolisme Biokimia25 HASIL DAN PEMBAHASAN FFAs infusi saline (kontrol) (●) infusi intralipid/heparin (intralipid) (○) FFAs berperan dalam disregulasi PDH pada model binatang pengerat diabetes tipe 2. Efisiensi pemutusan triasilgliserol diberikan pada emulsi intralipid

26 Maret 2007Metabolisme Biokimia26 Insulin Makanan pagi yang dikonsumsi subyek meningkatkan sedikit plasma insulin pada awal infusi. Pada 4 jam masa istirahat  konsentrasi arterial plasma insulin pada kontrol menurun, pada intralipid tidak ada perubahan. Infusi intralipid menimbulkan daya tahan insulin otot dan melemahkan aktivasi PDHa oleh insulin. Diabetes tipe 2 berhubungan dengan peningkatan fosforilasi PDH-E1α selama istirahat dan fosforilasi mengurangi aktivitas PDHa pada stimulasi insulin.

27 Maret 2007Metabolisme Biokimia27 Glikogen otot Pada 4 jam masa istirahat  tidak ada perubahan glikogen otot pada kedua percobaan. Selama 45 menit awal bergerak  konsentrasi glikogen otot menurun pada kedua percobaan.

28 Maret 2007Metabolisme Biokimia28 Aktivitas PDH dalam bentuk aktif (PDHa) infusi saline (kontrol) (■) infusi intralipid/heparin (intralipid) (□)

29 Maret 2007Metabolisme Biokimia29 Infusi intralipid mempertahankan peningkatan aktivitas yang lebih daripada penurunan aktivitas PDHa selama bergerak  induksi FFA yang menginhibisi aktivitas PDK. Peningkatan plasma FFA tidak menimbulkan sinyal yang menginduksi penghematan karbohidrat dalam rangka otot. Aktivitas PDH dalam bentuk aktif (PDHa)

30 Maret 2007Metabolisme Biokimia30 Protein PDH-E1α dan keadaan fosforilasi Gerakan yang dilakukan menginduksi penurunan fosforilasi pada sisi 1 dan 2 pada subunit katalitik dalam PDH-E1α pada komplek PDH. infusi saline (kontrol) (■) infusi intralipid/heparin (intralipid) (□) B: Representative blot protein PDH-E1α dan fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan 2. Fosforilasi PDH-E1α sisi 1 Fosforilasi PDH-E1α sisi 2

31 Maret 2007Metabolisme Biokimia31 Peningkatan fosforilasi PDH-E1α pada saat istirahat selama infusi intralipid tidak merusak regulasi aktivitas PDHa selama bergerak. Mekanisme regulator yang diaktivasi selama bergerak mengesampingkan regulasi yang digunakan oleh peningkatan FFAs pada saat istirahat. Gerakan bisa mengatasi disregulasi aktivitas PDH pada saat istirahat dalam diabetes tipe 2. Metabolisme lipid dan glukosa, normal selama bergerak pada otot penderita diabetes tipe 2. Protein PDH-E1α dan keadaan fosforilasi

32 Maret 2007Metabolisme Biokimia32 A: Hubungan diantara fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan aktivitas PDHa. B: Hubungan diantara fosforilasi PDH-E1α sisi 2 dan aktivitas PDHa. C: Hubungan diantara fosforilasi PDH-E1α sisi 1 dan 2. Tingkat fosforilasi PDH-E1α berhubungan terbalik dengan aktivitas PDHa selama bergerak.  Mengindikasikan kesamaan dan regulasi gabungan di kedua sisi.  Defosforilasi pada sisi terjadi pada keadaan acak.

33 Maret 2007Metabolisme Biokimia33 infusi saline (kontrol) (■) infusi intralipid/heparin (intralipid) (□) Kandungan PDK dan PDP mRNA Tidak ada perubahan signifikan yang tampak pada PDK1, PDK2, PDK3, atau PDP2 mRNA pada saat istirahat atau selama bergerak. Kandungan mRNA pada PDK4 Kandungan mRNA pada PDP1

34 Maret 2007Metabolisme Biokimia34 Perbedaan tingkat plasma FFA dan plasma insulin menyebabkan perbedaan pada ekspresi PDK4 mRNA. PDP1 mRNA mengalami penurunan regulasi pada rangka otot manusia selama bergerak, sementara PDP2 mRNA tidak dipengaruhi. Isoform PDKs dan PDPs mempunyai jaringan distribusi yang unik dan sensitifitas spesifik pada aktivator dan inhibitor. Ekspresi regulasi spesifik isoform PDK dan PDP merupakan perubahan penting pada fosforilasi PDH-E1α dan aktivitas PDH dan bisa menjadi target pada disregulasi PDH dalam diabetes tipe 2. Kandungan PDK dan PDP mRNA

35 Maret 2007Metabolisme Biokimia35 KESIMPULAN Gerakan yang dilakukan dan modifikasi infusi intralipid mengurangi fosforilasi PDH-E1α pada kedua sisi 1 dan 2 dalam rangka otot manusia. Ada hubungan terbalik antara fosforilasi PDH-E1α dan aktivitas PDHa dalam rangka otot manusia. Peningkatan plasma FFAs tidak merubah aktivitas PDHa, meskipun fosforilasi PDH-E1α meningkat.

36 Maret 2007Metabolisme Biokimia36 REFERENSI Frank, Rane A. W. The Molecular Origins of Specificity in the Assembly of a Multienzyme Complex. 2005. Elsevier. Holness, M. J, Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. 2003. Biochemical Society. Patel, M. S, Korotchkina, L. G. Regulation of the pyruvate dehydrogenase complex. 2006. Bochemical Society.

37 Maret 2007Metabolisme Biokimia37 Terima Kasih


Download ppt "Defosforilasi dan Aktivasi PDH-E1α pada Rangka Otot Manusia Selama Bergerak Pengaruh Infusi Intralipid Oleh: TINA DEWI ROSAHDI 20506001."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google