APLIKASI BIOTEKNOLOGI DI BIDANG PEMULIAAN MARKERS ASSISTED SELECTION (MAS)

TEKNIK PEMULIAAN TANAMAN Teknik merakit kultivar tanaman dengan keunggulan tertentu Misalnya: Tanaman tahan penyakit, Tanaman tahan lingkungan ekstrim (pH, kadar garam, dll), Tanaman dengan waktu panen pendek dan hasil panen tinggi, dLL. Berdasarkan METODE dikelompokkan: Konvensional Non-konvensional

KONVENSIONAL NON-KONVENSIONAL Persilangan Seleksi Mutasi Kloning Transfer gen

SELEKSI TANAMAN UNGGUL Konvensional (Penampakkan Luar) Non-Konvensional (Susunan DNA)

SELEKSI KONVENSIONAL Seleksi berdasarkan fenotipe (penampakan luar). Lamanya waktu sampai diperoleh galur-galur harapan yang secara genetik stabil. Jumlah genotipa yang harus ditangani, terutama pada saat awal-awal seleksi sangat besar. Membutuhkan investasi yang besar.

SELEKSI KONVENSIONAL Seleksi true genotype di lapang untuk karakter-karakter ketahanan terhadap hama dan penyakit dan toleransi terhadap cekaman abiotik sering dihadapkan pada kondisi escape (cekaman yang diharapkan tidak terjadi). Seleksi genotipa untuk karakter fisologis dan biokimiawi termasuk kandungan protein, kandungan zat besi dan sejenisnya membutuhkan analisis laboratorium yang tidak dapat dilakukan secara instant.

SELEKSI NON-KONVENSIONAL Prosesnya relatif lebih cepat dibanding teknik konvensional. Dikenal dengan istilah Marker Assisted Selection (MAS) MAS didasarkan pada keterpautan (linkage) antara karakter yang sedang menjadi target seleksi (trait of interest) dengan marka (penanda sifat) tertentu, baik berupa marka morfologis, fisiologis, biokimiawi, atau pun molekuler (DNA).

SELEKSI NON-KONVENSIONAL Karakter morfologis, fisiologis dan biokimiawi pada umumnya juga sangat diperngaruhi lingkungan, sehingga konsistensi fenotipenya sering diragukan. Seleksi berdasarkan marka molekuler tidak dipengaruhi faktor lingkungan sehingga menjanjikan akurasi yang lebih tinggi untuk seleksi true genotype.

TAHAPAN UMUM Marker Assisted Selection (MAS)

(1) SAMPLING JARINGAN TANAMAN (DAUN MUDA) (2) EKSTRAKSI/ISOLASI DNA (3) PCR (4) ELEKTROFORESIS GEL (5) ANALISIS MARKA

DNA extractions LEAF SAMPLING EKSTRAKSI DNA Mortar and pestles Porcelain grinding plates LEAF SAMPLING High throughput DNA extractions “Geno-Grinder” EKSTRAKSI DNA

Agarose or Acrylamide gels PCR-based DNA markers Generated by using Polymerase Chain Reaction Preferred markers due to technical simplicity and cost PCR Buffer + MgCl2 + dNTPS + Taq + Primers + DNA template PCR THERMAL CYCLING GEL ELECTROPHORESIS Agarose or Acrylamide gels

Agarose gel electrophoresis http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html UV transilluminator UV light

Acrylamide gel electrophoresis 1 UV transilluminator UV light

APA ITU MARKA MOLEKULER Rangkaian nukleotida atau lebih umum dikenal pasangan basa (DNA) yang karena keunikannya (urutan basa N-nya) dan keterpautannya dengan suatu karakter maka dapat dijadikan penanda. Marka molekuler hanya bermanfaat untuk seleksi genotipa bila keunikannya (urutan basa N-nya) dapat menjadi pembeda (polymorphism) antara dua genotipa yang digunakan sebagai tetua dalam perakitan suatu varietas.

KLASIFIKASI MARKA MOLEKULER (Gupta, et al. 2002) GENERASI PERTAMA (1980) Berdasarkan fragmen restriksi (Restriction Fragment Length Polymorphisms-RFLP). GENERASI KEDUA (1990) Meliputi RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), mikrosatelit (Simple Sequence Repeats-SSRs) dan AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) berbasiskan fingerprinting atau dikenal juga sebagai metode amplifikasi sekuen DNA menggunakan technologi PCR (Polymerase Chain Reaction).

KLASIFIKASI MARKA MOLEKULER (Gupta, et al. 2002) GENERASI KETIGA (Akhir 1990) Muncul dengan tingkat yang lebih spesifik yaitu pada sekuen DNA penyandi sifat (sekuen DNA yang terekspresi) dengan teknik cDNA (complementary DNA), seperti Expressed Sequence Tags-ESTs) dan SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms).

MARKA RFLP

MARKA RAPD Digunakan berdasarkan perbedaan amplifikasi PCR pada sampel DNA dari sekuen oligonukleotida pendek yang secara genetik merupakan kelompok marka dominan. Primer RAPD bersifat random dengan ukuran panjang biasanya 10 nukleotida.

KEUNGGULAN MARKA RAPD Kuantitas DNA yang dibutuhkan sedikit Hemat biaya Mudah dipelajari Primer yang diperlukan sudah banyak dikomersialisasikan sehingga mudah diperoleh

KELEMAHAN MARKA RAPD Tingkat reproduksibilitas pola marka kecil. Sangat sensitif terhadap variasi dalam konsentrasi DNA. Memerlukan konsentrasi primer dan kondisi siklus suhu yang optimal pada saat pengujian. Marka RAPD dominan Tidak mampu menampilkan perbedaan sekuen DNA yang homolog, di antara fragmen-fragmen yang ukurannya hampir sama (Bahagiawati, 2011).

Pola pita DNA marka RAPD Pola pita DNA marka RAPD. P1 = tetua 1, P2 = tetua 2, F1 = Hybrid, F7 = generasi ke 7

MARKA AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Dikembangkan untuk memperbaiki kelemahan marka RFLP yang prosesnya memakan waktu dan membutuhkan banyak DNA. DNA sampel dipotong oleh sepasang enzim restriksi. Selanjutnya PCR selektif dilakukan menggunakan primer yang memiliki adapter yang bersesuaian dengan lokasi restriksi. Hasil amplifikasi ini lalu dideteksi melalui elektroforesis gel. AFLP merupakan teknik yang bekerja atas dasar selektif PCR amplifikasi dari DNA fragmen yang degenerate dengan enzim retriksi. Pada dasarnya AFLP merupakan gabunga dari teknik RLFP dan teknik PCR

MARKA SSR (MIKROSATELIT) Sekuen DNA yang bermotif pendek dan diulang secara tandem dengan 2 sampai 5 unit nukleotida yang tersebar dan meliputi seluruh genom, terutama pada organisme eukariotik. Misalnya sekuen: GGC GGC GGC Pasangan primer mikrosatelit (forward dan reverse) diamplifikasi dengan PCR berdasarkan hasil konservasi daerah yang diapit marka (flanking-region) untuk suatu gen pada kromosom.

PERTIMBANGAN PENGGUNAAN SSR (MIKROSATELIT) Terdistribusi melimpah dan merata dalam genom, variabilitasnya sangat tinggi (banyak alel dalam lokus), sifatnya kodominan dan lokasi genom dapat diketahui. Alat uji yang memiliki reproduksibilitas dan ketepatan yang sangat tinggi Pengujian dengan SSR dapat mendeteksi campurancampuran yang sangat mirip secara morfologi dan membedakannya secara jelas dengan hasil elektroforesis. Beberapa tanaman yang terserang hama penyakit dan berakibat pada perubahan penampilan Alat bantu yang sangat akurat untuk membedakan genotipe, evaluasi kemurnian benih, pemetaan, dan seleksi genotipe untuk karakter yang diinginkan Studi genetik populasi dan analisis diversitas genetik.

KELEMAHAN SSR (MIKROSATELIT) Tidak tersedia pada semua spesies tanaman, sehingga untuk merancang primer baru membutuhkan waktu yang lama dan biaya yang cukup mahal (Bahagiawati, 2011)

Pola pita DNA marka mikrosatelit

MARKA SNP Mutasi titik di mana satu nukleotida disubstitusi oleh nukleotik lain pada lokus tertentu. Bersifat kodominan, berdasarkan pada amplifikasi primer yang berbasis pada informasi sekuen untuk gen spesifik. Memerlukan informasi sekuen untuk suatu gen yang menjadi target analisis Untuk pengadaan alat dan bahan memerlukan biaya yang sangat tinggi (Bahagiawati, 2011).

SELEKSI BERBASIS MARKA (MAS) Penggunaan marka molekuler saat ini telah meluas. Dapat membantu introgresi gen mayor ke dalam kultivar elit dengan metode silang balik (back cross). Sudah banyak digunakan oleh para pemulia tanaman di negara maju untuk karakterisasi tetua dalam koleksi plasma nutfah.

SELEKSI BERBASIS MARKA (MAS) Resistensi penyakit bulai pada tanaman jagung telah dapat dikarakterisasi secara molekuler pada alel tertentu dengan marka RFLP dan SSR (George et al. 2003). Lokus kuantitatif untuk ketahanan terhadap genangan pada fase vegetative pada tanaman padi telah berhasil diindetifikasi pada kromosom 9 menggunakan marka RFLP, RAPD dan AFLP (Toojinda et al., 2003)

SELEKSI BERBASIS MARKA (MAS) Lokus kuantititatif untuk sifat pengapuran endosperm dan kandungan amilosa biji padi juga telah teridentifikasi (Wang et al., 2007). Pada tanaman gandum (Triticum aesticum dan T. turgidum) penelitian dan penggunaan marka molekuler untuk program pemuliaan tanaman sudah sampai pada tahap aplikasi (Suprayogi et al., 2009)

Cost estimate per sample* Berapa Biaya untuk MAS? *biaya termasuk gaji staf Institute Country Crop Cost estimate per sample* (US$) Reference Uni. Guelph Canada Bean 2.74 Yu et al. (2000) CIMMYT Mexico Maize 1.24–2.26 Dreher et al. (2003) Uni. Adelaide Australia Wheat 1.46 Kuchel et al. (2005) Uni. Kentucky, Uni. Minnesota, Uni. Oregon, Michigan State Uni., USDA-ARS United States Wheat and barley 0.50–5.00 Van Sanford et al. (2001) Yu et al. 2000 Plant Breed. 119, 411-415; Dreher et al. 2003 Mol. Breed. 11, 221-234; Kuchel et al. 2005 Mol. Breed. 16, 67-78; and Van Sanford et al. 2001 Crop Sci. 41, 638-644.

TERIMA KASIH