KROMATOGRAFI Asal Nama Kromatografi Mikhail Tswett (1903) : Memisahkan klorofil dan pigmen lain dari ekstrak tanaman. Kolom diisi serbuk CaCO3 Dialiri petroleum eter  Terbentuk zona-zona berwarna Chromatos + graphos  Kromatografi (warna) (menulis) Sekarang  Kromatografi : Metode pemisahan senyawa kimia yang didasarkan pada perbedaan distribusi senyawa tersebut diantara dua fasa yaitu fasa gerak dan fasa diam

Penggolongan Kromatografi Berdasarkan jenis fasa gerak/fasa diam yang digunakan Kromatografi LC GC LLC LSC GLC GSC 2. Berdasarkan mekanisme pemisahan mekanisme adsorpsi mekanisme partisi mekanisme penukar ion mekanisme penyaringan molekul mekanisme afinitas

3. Berdasarkan teknik pelaksanaan kromatografi kolom konvensional kromatografi kolom kromatografi gas (GC) kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) Kromatografi kromatografi planar KLT kromatografi kertas 4. Berdasarkan polaritas relatif fasa gerak dan fasa diam Normal Phase (fasa diam > fasa gerak) Kromatografi Reserved Phase (fasa diam < fasa gerak)

5. Berdasar prinsip pemisahan Partisi  dasarnya perbedaan kelarutan Adsorpsi  dasarnya perbedaan daya serap Pertukaran ion  dasarnya perbedaan muatan Ekklusi/permeasi gel  dasarnya ukuran partikel 6. Berdasar cara pengembangan Elusi Frontal Displacement

Keterangan: Elusi: sampel ditempatkan 1 kali diujung fasa gerak, kemudian dialiri fasa gerak terus menerus. Dengan cara elusi sangat banyak digunakan dalam kromatografi analitik (Kwantitatif). Dengan mengukur luas puncak romatogram  kemudian dibanding dengan standar. Caranya: 1. Cut dan timbang, 2. Planimetri (ukur luas puncak), 3. Integrator (pencacah). Frontal: Komponen sampel dan fasa gerak dialirkan terus menerus. Dapat digunakan untuk mengumpulkan salah satu komponen dari komponen yang lain, tetapi tidak bisa untuk analisis kwantitatif. Displacement: hampir sama dengan gabungan elusi dan frontal. Sampel diikuti fasa gerak X, kemudian fasa gerak Y. Sampel + fasa gerak X, kemudiamn sampel + fasa gerak Y. Metode Frontal dan Displacement banyak digunakan untuk analisa preparatif, yaitu untuk isolasi komponen dari campurannya.

Keterangan: Partisi fase terbalik: FD (non polar) FG (polar)

Dasar retensi pada proses pemisahan dgn kromatografi Diff migration S C A Am Fasa Gerak Cm Fasa Diam Cs As

TEORI KROMATOGRAFI Dasar : Kromatografi kolom C fasa gerak fasa diam Distribusi molekul sampel/cuplikan ditentukan oleh tetapan kesetimbangan yang disebut koefisien distribusi K = koefisien distribusi Cs = konsentrasi cuplikan pada fasa diam Cm = konsentrasi cuplikan pada fasa gerak K = Cs/Cm Bila K >  Cs >  molekul cuplikan lebih lama tinggal di fasa diam

k’ = K. Vs/Vm Dalam Kesetimbangan Dinamis :  molekul dalam fasa gerak  molekul total Fraksi waktu tinggal dalam fasa gerak = Cm.Vm Cm.Vm + Cs.Vs = 1 1 + Cs.Vs/Cm.Vm = 1 = 1 + K. Vs/Vm k ’ 1 = 1 + k ‘ k ‘ = faktor kapasitas k’ = K. Vs/Vm

Bila kecepatan alir fasa gerak = µ  kecepatan alir molekul komponen = µ 1 1 + k ‘ Analog untuk komponen x, y dan z 1 1 + k ‘x µ x = 1 1 + k ‘y µ y = Bila  tetap maka x, y, z tidak bergantung pada  tetapi bergantung pada k’x, k’y dan k’z. 1 1 + k ‘z µ z =

RETENSI Ditahannya komponen cuplikan dalam menyusuri kolom oleh fasa diam tR (waktu retensi) tR = panjang kolom kecepatan Waktu yang dibutuhkan oleh komponen x untuk melewati kolom sepanjang L (time of retention) tRx = L tm = to = L/ Agar tr tetap maka Vs/Vm harus tetap tr adalah fungsi dari k’, L dan  k’ adalah fungsi dari Vs/Vm 1 1 + k ‘x µ tR x= L (1 + k ‘x) Sehingga tr suatu komponen akan tetap Jika , K, Vs/Vm, L tetap µ Vs/Vm bergantung ukuran butir, keseragaman ukuran tRx = tm (1 + k ‘x) Vm adalah volume kosong dalam kolom yang tidak ditempati fasa diam k’ = K. Vs/Vm

tr’ = tr - tm tm = to tr’1 tr1 tr’2 tr2 tr’ = waktu penahanan bersih dari komponen

Keterangan: Poor Good Best Untuk mengukur baik tidaknya digunakan faktor yang disebut selektifitas (), yaitu perbandingan antara tr bersih 2 komponen yang ditunjukkan dari 2 puncak yang berdekatan

k’ = 𝑡𝑟−𝑡𝑚 𝑡𝑚  (Selektifitas/Retensi relatif) tR(2) - tm  = VR (Volume retensi) VR = tR . F Vm = tm. F VR/Vm = tm . (1 + k ‘) . F tm . F = 1 + k ‘ VR = Vm (1 + k ‘)

Besaran tr dan k’ disebut besaran Termodinamika, karena besaran ini tergantung dari sifat kolom dalam menahan komponen. Untuk mengubah keadaan dari a menjadi b, c (poor menjadi good, best) maka yang perlu diatur adalah besaran Kinetika (efisiensi tinggi dan waktu singkat). Besaran Kinetika: Lebar dasar puncak (peak width) w Efisiensi jumlah kolom (plate number) N Tinggi ekivalen plate teoritis (HETP) H Resolusi (Rs) yaitu besaran yng menunjukkan kualitas pemisahan dari 2 komponen yang berdekatan.

 88,2% h  =2,354  50% h

Dan (c)  w relatif tidak berubah Rs untuk C dan B relatif sama, yang berbeda tR nya Hal ini ternyata berkaitan dengan faktor kinetik dan termodinamika

Ini akan mempengaruhi w B Komponen yang melewati fasa diam akan melintasi dengan jalan yang berbeda-beda.Inilah yang disebut Difusi Eddy Ini akan mempengaruhi w Apa yang mempengaruhi besar/kecilnya difusi Eddy ? Keseragaman ukuran partikel/butir fasa diam Homogenitas dari pengisian kolom.

C Transfer massa fasa gerak Ada interaksi fasa diam dan fasa gerak pada daerah yang pinggir  ini perlu waktu Semakin pekat fasa gerak yang digunakan maka w akan semakin besar

D Transfer massa fasa gerak yang terhenti (stagnant) Adanya fasa gerak yang jenuh dipori, akan semakin lambat untuk kembali Semakin banyak pori dari fasa diam maka faktor ini akan semakin besar. Untuk memperkecil digunakan solid support yang baik  pemilihan solid support. Berpori atau tidak.

E Transfer massa fasa diam Yang mempengaruhi besar/kecilnya faktor ini adalah ketebalan dari fasa diam (khususnya untuk krom. L-L

Yang mempengaruhi w Difusi Eddy Transfer massa fasa diam Transfer massa fasa gerak Transfer massa fasa gerak yang terhenti (stagnant)

N (Jumlah Plate) Sepanjang fasa gerak  komponen akan terdistribusi L HETP = L/N L  Tetap H,N  Besaran kinetik yang dapat diubah

Bagaimana Mengubah N Jumlah keseimbangan Dengan mengukur tr dan   dapat diketahui N. Dengan kata lain N dapat diketahui dari data eksperimen. Mengubah tr berarti mengubah kolom atau K Untuk mengukur   sulit maka yang diukur adalah  atau w.

Agar w kecil maka N harus diperbesar Berarti banyaknya kesetimbangan harus besar. Untuk mengubah a) menjadi b) berarti meningkatkan efektifitas kolom Agar tr tetap, w kecil  maka N diperbesar, untuk itu HETP harus diubah. Besaran H ini dipengaruhi oleh banyak faktor.

Tiga faktor utama yang menentukan besar/kecil HETP Difusi Eddy Difusi longitudinal Transfer massa Persamaan Van Deemter

Suku A  = faktor geometri (keseragaman partikel) dp = diameter partikel isi kolom Homognitas dari pengisian kolom

Difusi longitudinal Transfer massa Dm =Koef difusi analit pada fasa pembawa (gas) Transfer massa Tergantung dari k’ (kapasitas) Tebal lapisan cairan fasa diam Koef difusi komponen dalam fasa diam maupun fasa gerak Tetapan gas Diameter partikel isi kolom

Kurva Van Deemter

Cara membuat kurva Van Deemter Dicari  optimum  H minimum  N maksimum  Kolom efisien. Caranya: Ukur tr dan w dari suatu kromatogram standar. N dapat dihitung L dapat diukur. H dapat dihitung. Ulangi untuk  yang lain. Buat grafik  versus H.

Cara mencari persamaan Van Deemter Buat kromatogram untuk komponen tertentu dengan 3 harga  yang berbeda Hitung nilai H untuk tiap  Tulis persamaan Van Deemter Hitung A, B dan C dari 3 persamaan dengan 3 variabel

Ukuran Efisiensi kolom  N, H dan Rs Suatu kolom dikatakan efisien bila dapat memisahkan sebanyak mungkin komponen dalam waktu yang singkat. Rs (Resolusi/Daya Pisah) adalah suatu besaran yang menyatakan gambaran dari 2 puncak yang berdekatan itu terpisah. Kualitatif = 1 Kuantitatif  1.5 Yang dituntut adalah w kecil dan tr kecil tetapi Rs > 1.5 N >>> H <<<

Resolusi Bagaimana cara memperbesar Rs ? Rs fungsi dari apa ? (N, k’, ) w1  w2 Buktikan:

Faktor kapasitas, tergantung pada sifat komponen dan karakteristik kolom Daya pilih kolom, tergantung pada komposisi fasa gerak, pH dan temperatur Koefisien kolom, tergantung pada panjang kolom dan HETP