KROMATOGRAFI PRINSIP DASAR: METODE PEMISAHAN BEBERAPA TAHAP (MULTI STAGE) TERJADI BEBERAPA KALI PROSES KESETIMBANGAN ANTARA DUA FASE. ALAT YG DIGUNAKAN : TABUNG (DISEBUT KOLOM) YANG MENGANDUNG BAHAN PADAT GRANULAR YG SERING DIIKATKAN / DILAPISI FASE CAIR DGN GAYA FISIK ATAU KIMIA  FASE DIAM. FASE GERAK : ELUEN YANG MENGALIR TERUS MENERUS MELEWATI KOLOM.

SAMPEL DILETAKKAN DIATAS KOLOM, LALU ELUEN DIALIRKAN MELEWATI KOLOM  TERJADI BEBERAPA KALI KESETIMBANGAN ANTARA DUA FASE, KONSTITUEN/ZAT TERLARUT AKAN BERGERAK KEBAWAH. ADA SEDIKIT PERBEDAAN RATIO DISTRIBUSI YG DIPERLUKAN UNTUK ZAT TERLARUT BERGERAK DENGAN KECEPATAN YANG BERBEDA MELALUI KOLOM DAN TERJADILAH PROSES PEMISAHAN SATU DARI YG LAINNYA. GAYA PEMISAHAN PADA METODE MULTI STAGE INI LEBIH BESAR DARI PADA SINGLE-STAGE.

KATA “CHROMATOGRAPHY” DIKENALKAN OLEH TSWETT (1906)  “CHROMA” ATAU“COLOR” ARTINYA WARNA DAN “ GRAPHEIN” ATAU “WRITE” ARTINYA MENULIS. PEMISAHAN KLOROFIL DAN PIGMEN DARI TANAMAN MENGGUNAKAN TABUNG ( KOLOM) YG DIISI PADATAN KALSIUM KARBONAT DAN DIELUSI DENGAN PELARUT ORGANIK  TERJADI PEMISAHAN YG BERUPA PITA PITA YG BERWARNA PADA KOLOM KROMATOGRAFI : METODE PEMISAHAN DIMANA KOMPONEN KOMPONEN TSB TERDISTRIBUSI DIANTARA FASE DIAM ( STASIONER) DAN FASE GERAK ( MOBILE) FASE DIAM : PADATAN BERPORI YG DIGUNAKAN SENDIRIAN ATAU DILAPISI DGN FASE DIAM ZAT CAIR ( DISEBUT DGN PADATAN PENDUKUNG) FASE GERAK : DISEBUT ELUENT ATAU PEMBAWA PROSES DIMANA ELUENT BERGERAK DGN MEMBAWA KOMPONEN DISEPANJANG KOLOM DISEBUT: ELUSI

HASIL PEMISAHAN DIGAMBARKAN DALAM KURVA “KROMATOGRAM” 10/8/2017 PEMISAHAN DAPAT TERJADI KARENA KOMPONEN DARI SAMPEL MEMPUNYAI PERBEDAAN AFINITAS DIANTARA FASE DIAM DAN FASE GERAK DAN PERGERAKKAN MEMPUNYAI KECEPATAN YG BERBEDA BEDA SEPANJANG KOLOM. HASIL PEMISAHAN DIGAMBARKAN DALAM KURVA “KROMATOGRAM” TIAP PUNCAK MENGGAMBARKAN KONSTITUEN SAMPEL YG TERPISAH AREA DIBAWAH PUNCAK MENGGAMBARKAN UKURAN JUMLAH RELATIF DARI KONSTITUEN. DASAR KROMATOGRAFI: MENGUBAH SISTEM KESETIMBANGAN STATIS MENJADI DINAMIS ANTARA FASE DIAM DAN FASE GERAK

TYPE DARI METODE KROMATOGRAFI ADA 4 TYPE BERDASARKAN FASE GERAK -- FASE DIAM : CAIR – CAIR ; CAIR – PADAT ; GAS – CAIR ; GAS – PADAT KROMATOGRAFI GAS (GC) TERMASUK DALAM TYPE GAS – CAIR (GLC) DAN GAS – PADAT (GSC) KROMATOGRAFI CAIR (LC) TERMASUK DALAM TYPE CAIR- CAIR (LLC) DAN CAIR – PADAT (LSC) KROMATOGRAFI PENUKAR ION TERMASUK TYPE CAIR PADAT KROMATOGRAFI KERTAS (PC) DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC) TERMASUK TYPE CAIR –CAIR (LLC) DENGAN MENGGUNAKAN PADATAN PENDUKUNG YG BERUPA KERTAS/SELULOSA ATAU SILIKA GEL.

KROMATOGRAFI BERDASARKAN ASAS TERJADINYA PROSES PEMISAHAN : ADSORPSI (FASE DIAM : PADAT & FASE GERAK : CAIR / GAS), pemisahan tergantung perbedaan polaritas molekul. contoh : Kromt kolom konvensional Kromt lapis tipis Kromt Penukar Ion Kromt gas padat Kromt cair kinerja tinggi PARTISI (FASE DIAM: CAIR & FASE GERAK : CAIR), pemisahan tergantung perbedaan koefisien distribusi. Contoh: Kromt kolom Kromt kertas Kromt gas cair

3. FILTRASI (FASE DIAM: PADAT & FASE GERAK : CAIR), pemisahan tergantung perbedaan struktur dan ukuran molekul 4. SUHU KRITIK (PENGEMBANGAN KROMATOGRAFI GAS DAN HPLC & FASE GERAK : CO2 SUPERKRITIK ), Sistem kesetimbangan dalam kromatografi lebih ditekankan pada sistem kesetimbangan partisi( sifatnya ideal) dari pada adsorpsi (sufatnya non ideal)

Adsorption Chromatography Adsorption chromatography is probably one of the oldest types of chromatography around. It utilizes a mobile liquid or gaseous phase that is adsorbed onto the surface of a stationary solid phase. The equilibriation between the mobile and stationary phase accounts for the separation of different solutes.

Partition Chromatography This form of chromatography is based on a thin film formed on the surface of a solid support by a liquid stationary phase. Solute equilibriates between the mobile phase and the stationary liquid.

Ion Exchange Chromatography In this type of chromatography, the use of a resin (the stationary solid phase) is used to covalently attach anions or cations onto it. Solute ions of the opposite charge in the mobile liquid phase are attracted to the resin by electrostatic forces.

KLASSIFIKASI KROMATOGRAFI GAS SFC LIQUID GSC GLC COLUMN PLANAR LSC LLC BPC IEC EC TLC PC GPC GFC

SFC =SUPERCRITICAL FLUID CHROMT = KROMT CAIR SUPERKRITIK GSC = GAS SOLID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI GAS PADAT= KGP GLC = GAS LIQUID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI GAS CAIR =KGC LSC =LIQUID SOLID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI CAIR PADAT =KCP LLC =LIQUID LIQUID CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI CAIR CAIR =KCC BPC =BONDED PHASE CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI FASE TERIKAT

IEC =ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI PENUKAR ION EC =EXCLUSION CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI EKSKLUSI TLC =THIN LAYER CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PC =PAPER CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI KERTAS GPC =GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI PERMIASI GEL GFC =GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY = KROMATOGRAFI FILTRASI GEL

KROMT METODE PEMISAHAN F. GERAK F. DIAM TYPE KESETM GSC/KGP GLC/KGC GBPC LLC LSC LBC IEC GPC PC TLC SFC GAS – PADAT GAS – CAIR GAS – BONDED PHASE CAIR – CAIR CAIR – PADAT CAIR – BONDED PHASE PERTUKARAN ION PERMIASI GEL CAIR- CAIR CAIR-PADAT GAS/ CAIR CAIR GAS CAIR GAS/CAIR (CO2 SC) PADAT F.ORG TERIKAT F. ORG TERIKAT RESIN Z. PDT POLIMER ABSORPSI PARTISI ADSORPSI / PARTISI ADSORPSI ADSORPSI/PARTISI PENYARINGAN

KROMATOGRAFI ELUSI PADA DASARNYA HAMPIR SEMUA PROSES KROMATOGRAFI ADALAH ELUSI DALAM KOLOM KROMT ELUSI, ZAT YANG DIPISAHKAN TERGANTUNG PADA PERBEDAAN PARTISI / DISTRIBUSI ANTARA FASE DIAM (TERPACKING DALAM KOLOM ) DAN FASE GERAK (MENGALIR MELALUI KOLOM)

JIKA DALAM SAMPEL TERDAPAT ZAT A DAN B YANG AKAN DIPISAHKAN , MAKA SAAT KEDUANYA BERGERAK KEBAWAH SEPANJANG KOLOM, KECEPATANNYA TERGANTUNG PADA RATIO DISTRIBUSI (DC ATAU m ) Dalam kromatografi ratio distribusi lebih sering disebut dengan ratio kapasitas atau faktor kapasitas (k )

Jika harga k kecil, maka komponen / analat akan bergerak dalam kolom lebih cepat . Jika eluen bergerak kebawah didalam kolom dengan kecepatan alir linear sebesar u (cm/sec), maka pergerakan komponen/analat pada kecepatan linear yang sama adalah u/(1 + k) (cm/sec). Bila komponen A dan B mempunyai harga k yang berbeda cukup besar, maka akan terjadi pemisahan.

tm, to = Waktu migrasi , tr = waktu retensi , h = tinggi puncak tw, W = lebar puncak , random fluctuations longitudinal diffusion (negligible in liquids) eddy diffusion or “channeling”

PENGARUH KECEPATAN MIGRASI RELATIF DAN PELEBARAN PITA PADA RESOLUSI KONSENTRASI B A B A JARAK MIGRASI BEBERAPA VARIABEL KIMIA DAN FISIKA DAPAT MEMPENGARUHI KECEPATAN PADA PEMISAHAN PITA/PUNCAK DAN LEBAR PITA AGAR DIDAPAT PEMISAHAN YG SEMPURNA : MENAMBAH KECEPATAN PADA PITA PEMISAHAN MENGURANGI KECEPATAN DARI LUAS/LEBAR PITA ALTERNATIF TSB DAPAT DILIHAT PADA GAMBAR DIBAWAH INI.

KROMATOGRAM MULA MULA DENGAN PUNCAK YG OVERLAP DIPERBAIKI DENGAN MENAMBAH KECEPATAN PITA PEMISAHAN SIGNAL DETEKTOR B DIPERBAIKI DENGAN MENGURANGI KECEPATAN DARI LUAS PITA C W A K T U

KECEPATAN MIGRASI ZAT TERLARUT KURANG EFEKTIFNYA KOLOM KROMATOGRAFI DALAM MEMISAHKAN KOMPONEN TERGANTUNG PADA KECEPATAN RELATIF DARI KOMPONEN/ ANALAT YG DIELUSI, DITENTUKAN OLEH PERBANDINGAN PARTISI KOMPONEN / ANALAT DIANTARA 2 FASE. PERBANDINGAN PARTISI DISTRIBUSI ANALAT DIANTARA FASE DIAM DAN FASE GERAK DIGAMBARKAN CUKUP SEDERHANA. ANALAT BERADA DALAM KESETIMBANGAN DIANTARA DUA FASE A (FASE GERAK) A (FASE DIAM) KONSTANTA KESETIMBANGAN , K, KOEFISIEN PARTISI DIDEFINISIKAN SEBAGAI KONSENTRASI MOLAR ANALAT DALAM FASE DIAM DIBAGI DENGAN KONSENTRASI MOLAR ANALAT DALAM FASE GERAK.

Jika K bertambah besar, maka komponen akan lebih lama melewati kolom (1) Harga K idealnya konstan, tidak tergantung pada konsentrasi, tetapi dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti temperatur. Jika K bertambah besar, maka komponen akan lebih lama melewati kolom Untuk pemisahan diasumsikan bahwa: Kolom panjangnya tetap dan alirannya konstan

Tiap komponen dalam sampel punya tR yang berbeda beda. 2. Waktu retensi (tR) Adalah waktu yang diperlukan diantara injeksi sampel dan munculnya puncak / pita komponen pada detektor dari kolom kromatografi Volume retensi (VR) adalah volume yang diperlukan oleh fase gerak untuk mengelusi komponen sampai maksimum dari kolom Tiap komponen dalam sampel punya tR yang berbeda beda. Waktu yang diberikan untuk fase gerak atau komponen yang tidak tertahan melewati kolom disebut waktu migrasi / waktu mati ,tM atau to

/ VR /t0 Dimana VR = tR x kec. alir Puncak kecil sebelah kiri menggambarkan komponen yang tidak tertahan oleh fase diam pada kolom dan mencapai detektor hampir langsung setelah elusi dimulai. Waktu migrasi / waktu mati melengkapi pengukuran dari kecepatan migrasi rata rata dari fase gerak. tM sangat penting dalam identifikasi puncak komponen/ analat.

Kecepatan linier rata rata dari migrasi komponen / analat : V = L / tR ----(2) dimana L panjang kolom kecepatan linier rata rata untuk fase gerak adalah: u = L / tM --- (3) 3. Hubungan antara kecepatan migrasi dan perbandingan partisi V = u x f dimana f adalah fraksi dari waktu komponen keluar dari fase gerak. f = jumlah mol komponen dalam f.gerak) / jumlah total mol komponen dalam kolom

Sehingga (4)

Tiap komponen mempunyai harga K sendiri sendiri. Persamaan tersebut menunjukkan faktor faktor yang diperlukan untuk elusi komponen dan bagaimana dua komponen dapat dipisahkan. Tiap komponen mempunyai harga K sendiri sendiri. Harga K besar , elusi lebih panjang / lama Faktor lain yang mempengaruhi semua pemisahan yaitu: Vs umumnya bertambah dalam retensi VM umumnya berkurang dalam retensi U kecepatan pemisahan bertambah Vs dan VM dapat diubah dengan mengganti diameter dan panjang kolom untuk column packing spesifik . U dapat diubah dengan mengganti kecepatan alir.

4. Faktor kapasitas Adalah parameter yang sangat penting dimana digunakan untuk menggambarkan kecepatan migrasi komponen pada kolom. Faktor kapasitasnya k’ didefinisikan sbg: k’ = KVS / VM ---- (5) dimana K = koef. Partisi dan harga k’ konstan untuk kondisi kolom. Substitusi pers 5 ke pers 4, sehingga diperoleh : V = u [1 / (1 + k’)] ---- (6)

Untuk menunjukkan harga k’ dapat diturunkan dari kromatogram, maka substitusi pers 2 dan 3 ke pers 6 . ( 7) Atau ( 8 ) Dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa bagaimana menentukan harga k didasarkan pada waktu elusi

Jika faktor kapasitas < 1, elusi terjadi lebih cepat sehingga penentuan waktu retensi yang akurat sangat sulit. Jika faktor kapasitas lebih besar dari 20 ( antara 20 - 30), elusi menjadi terlampau panjang. Idealnya faktor kapasitas mempunyai harga antara 1 dan 5. Faktor kapasitas dalam GC dapat divariasikan dengan mengubah temperatur dan packing kolom. Dalam LC, faktor kapasitas dapat dimanipulasi dengan cara memvariasikan komposisi fase diam dan fase gerak.

Faktor Selektifitas (α) Faktor selektifitas, α, pada kolom untuk dua komponen A dan B didefinisikan sebagai : Dimana KB = perbandingan partisi untuk komponen B yang tertahan lebih kuat , KA = adalah konstan untuk komponen A yang terelusi lebih cepat atau tidak tertahan. Substitusi pers 5 kedalam pers 9 , maka diperoleh JIka menghitung faktor selektifitas, komponen A terelusi lebih cepat dari pada komponen B, maka faktor selektifitasnya selalu lebih besar dari pada 1

Dalam kromatografi (GLC), bentuk kromatogram yang bagus adalah berupa garis tegak. Garis yang tipis merupakan pemisahan yang sempurna, tapi keadaan ideal ini sulit tercapai Bentuk kromatogram yg sering muncul adalah kurva melebar (kurva gauss) atau puncak yang mengekor atau pemanjangan dimuka. B C A D injeksi

Hal tersebut disebabkan oleh (Teori laju/ kec): Difusi Eddy (olakan): Disebabkan oleh kecepatan gas pembawa yang tidak sama didalam kolom karena bagian dari pori yang dilalui tidak sama panjang :Multipath effect (pengaruh jalan berganda) A B 2. Difusi Molekuler: terutama dalam fase gas, dimana molekul cuplikan dapat bergerak dalam arah yang salah yang disebabkan oleh difusi eddy

3. Kesetimbangan yang lambat: beberapa molekul tetap tinggal lama, sedangkan lainnya hanya sebentar dalam fase diam. Hal ini disebabkan oleh perbedaan suhu yang kecil (GLC) 4. Harga K yang tidak tetap: Disebabkan oleh perbedaan ratio distribusi dalam kolom. Keempat faktor tsb menyebabkan perbedaan puncak. Faktor 1, 2 dan 3 menyebabkan pelebaran puncak yg simetris. Faktor 4 menyebabkan pelebaran puncak yg tak simetris. Keadaan yg lebih buruk akan terjadi puncak puncak yg overlap.

Pelebaran pita dan efisiensi kolom Untuk mendapatkan pemisahan yg optimal, tajam, bentuk kurva yg simetris. Pelebaran puncak harus dibatasi juga efisiensi kolom harus diperhitungkan. Pemisahan puncak puncak itu berhubungan dengan 2 faktor: Efisiensi kolom: pelebaran puncak merupakan hasil dari bentuk kolom dan kondisi operasional. Efisiensi Pelarut (Faktor selektifitas): Hasil dari interaksi antara komponen dengan fase diam, hal ini menentukan kedudukan relatif dari jalur jalur komponen pada sebuah kromatogram.

Efisiensi Kolom Diukur sebagai jumlah pelat teoritis N, Height equivalent of a theoritical plate (HETP) = ketinggian ekivalen terhadap pelat teoritis. HETP = H = L / N N = jumlah pelat teoritis dari suatu kolom L = panjang kolom Efisiensi kolom tergantung pada: Pelarut = fase diam Zat terlarut = komponen Suhu Kecepatan aliran dari gas pembawa Ukuran dari komponen

Banyak faktor yg mempengaruhi N atau HETP, tetapi secara kuantitatif teori yg menyatakan pengaruh tsb sangat sukar. Akan tetapi ada 2 teori yang dapat mempengaruhi N atau HETP yaitu: Teori pelat Teori laju / kecepatan

TEORI PELAT – N Konsep tentang pelat adalah imajisi, karena suatu kolom tidak memiliki pelat pelat. Tetapi merupakan gambaran dari partikel partikel yang tertarik/ terikat fase cair. Dasar teori pelat adalah Distribusi Kesetimbangan dari pemisahan komponen terjadi diantara fase diam dan fase gerak yang terjadi didalam pelat. Komponen bergerak kebawah kolom oleh transfer pada fase gerak yg disetimbangkan dari satu pelat ke pelat yang berikutnya.

Pelat atau HETP adalah tinggi/ panjang dari kolom yg cukup untuk tercapainya kesetimbangan komponen antara 2 fase. Lebih banyak pelat yg dimiliki, maka akan memberikan puncak yg lebih kecil, atau efisiensi kolom lebih baik. Untuk menghitung jumlah pelat teoritis N dari kromatogram dapat ditentukan dari waktu retensi (tR) dan lebar puncak (w)

tR injeksi Lebar puncak

Jumlah pelat dapat dihitung sebagai berikut : N = 16 (tR / w)2 Dimana tR adalah waktu retensi dan w = lebar puncak Atau jumlah pelat dapat pula dihitung dari setengah tinggi puncak / setengah lebar puncak w1/2 N = 5,54 (tR / w1/2 )2 Gambar dibawah ini menunjukkan hasil elusi dengan jumlah pelat yang berbeda N = 100 N = 1000

Harga H dapat diperoleh bila panjang kolom L diukur Harga N tsb dapat dihitung dari uraian dibawah ini: Jml molekul (L-1σ) (L+ 1σ) H= (σ)2 /L L Jarak migrasi Packing L Sampel masuk detektor

Efisiensi kolom H didefinisikan : H = σ2 /L Tinggi pelat = panjang kolom yg mengandung fraksi analat yg ada diantara L dan (L ± σ) Daerah dibawah kurva yg dikelilingi oleh ± σ kira kira 68% dari total daerah. Tinggi pelat kira kira mengandung 34% analat. JIka varians pada kurva gaussian didasarkan pada waktu dan disimbolkan τ2 (detik2) untuk membedakan dgn σ2 (cm2 ) Hubungan kedua standar deviasi tsb: τ= σ / (L/tR ), dimana ( L / tR) kecepatan linier rata rata analat (cm / dt). Tangen pada puncak perpotongan 2 sisi puncak membentuk segitiga dan luasannya ± 96% dari daerah total dibawah puncak termasuk ± 2σ Intersep dari kurva kira kira ± 2τdari maksimum dan w=4τ adalah dasarsegitiga

Substitusi hub tsb dengan pers diatas Atau Substitusi L dengan harga H = σ2 /L didapat: Untuk mendapatkan N , subs ke N = L / H didapat atau N dapat dihitung dari 2 waktu pengukuran tR dan w

Variabel yang mempengaruhi efisiensi kolom Pengaruh kecepatan alir fase gerak: pelebaran pita tergantung pada lamanya waktu fase gerak yang kontak dengan fase diam. Gambar tsb menunjukkan efisiensi kolom tgt pada kec alir fase gerak.

Dari gb tsb keduanya menunjukkan tinggi pelat minimum / efisiensi max, terjadi pada kec alir yg rendah. Kolom pada GC panjangnya dapat mencapai 50 m atau lebih, sedangkan kolom pada cair dapat lebih panjang dari 25 – 50 cm, sebab tetesan sepanjang kolom tekanannya cukup tinggi. Jumlah pelat N pada GC lebih banyak dari pada LC Pengaruh ukuran diameter partikel : efisiensi kolom bertambah dengan berkurangnya ukuran partikel packing kolom, yaitu berupa lapisan yg tipis ( fase diam cairan yg diadsorb pada padatan) dan viskositas fase gerak yg rendah. Pengaruh temperatur : kenaikan temperatur juga mengurangi pelebaran pita.

Teori laju / kecepatan. Dikembangkan oleh van Deemter Teori pelat diasumsikan bahwa kolom secara matematik ekivalen dengan pelat kolom. Kesetimbangan zat solut terjadi antara fase gerak dan fase diam untuk setiap pelat dan dapat memprediksi beberapa aspek dari bentuk kromatografi Teori pelat mengabaikan konsep difusi solut dan jejak aliran. Teori laju dapat memprediksi pengaruh pada beberapa faktor dari bentuk kolom seperti: sifat fase, difusivitas solut, koef partisi, kec. Fase, ketebalan fase, ukuran dan porositas padatan pendukung, dan kec. Alir.

Persamaan deferensial partial dari van Deemter untuk isoterm linier dihasilkan dalam fungsi konsentrasi effluent.

Besaran A , B dan C menjadi penyebab utama terjadinya pelebaran pita / puncak. Simbol “A” = Difusi Eddy (olakan ) : efek jalan ganda ( perbedaan panjang jalan dalam kolom) Simbol “B” = Difusi molekuler : pendifusian solut dalam gas pembawa Simbol “C” = Penahanan terhadap perpindahan massa : ukuran dari jumlah atau viskositas dari fase diam (cair) didalam kolom

Sejak kolom dipacking, maka tidak ada yg dapat mengurangi nilai A Pengaruh tsb dapat direduksi dengan : ukuran packing reguler, diameter packing kecil, tidak ada packing yg hilang/ lepas atau ruang mati dalam kolom.

Diffusi molekuler

Pengaruh “C”, Penahanan terhadap perpindahan massa. Pengaruh pada “B” adalah tergantung aliran. Jika aliran ditambah, maka waktu untuk difusi berkurang. Pengaruh “C”, Penahanan terhadap perpindahan massa. Waktu untuk solut mencapai kesetimbangan diantara fase gerak dan fase diam. Ketebalan atau viskos dari fase diam memperbesar harga C Untuk meminimalkan pengaruh C: Gunakan lapisan tipis dari fase diam pada padatan pendukung Viskos fase rendah

Jika harga harga A, B dan C tertentu, maka dapat dilihat persamaan van Deemter harus terdapat kec laju gas pembawa/ pengangkut optimum, dimana kita akan bekerja pada keadaan tsb. Sehingga dapat dikatakan H minimum = µ optimum. JIka digambarkan H terhadap µ, maka diperoleh kurva parabola.

Cara praktis untuk meningkatkan efisiensi kolom: Padatan pendukung harus terbuat dari partikel partikel yang kecil, ukurannya sama, biasanya dari tanah diatome yg mempunyai ukuran mesh 100 -200. Kecepatan aliran gas pembawa adalah optimum pada H minimum Gas pembawa dgn BM besar biasanya N2 akan tetapi dapat juga He atau H2 Fase diam yg digunakan harus mempunyai viskos yang rendah Banyaknya/jumlah fase diam yg dipakai biasanya 1 – 10% dari berat padatan pendukung

Perbandingan antara gas pembawa yg masuk dan yg keluar harus rendah, tekanan yg masuk 1,5 – 2,5 atm Pemisahan akan lebih baik pada suhu kolom yg rendah tetapi dgn demikian waktu analisa menjadi lama Diameter kolom yang kecil memberikan pemisahan lebih baik (1/8” atau 1/16” ) Delapan cara tsb dapat menaikkan efisiensi kolom, sehingga puncak puncak yg terjadi sekecil mungkin. Disamping cara tsb juga faktor yg lain yaitu efisiensi pelarut ( faktor selektifitas).

Resolusi (R) adalah pemisahan nyata antara dua puncak yang berdekatan. RS = 2 d/ (wa + wB ) = 2 [(tR)A – (tR)A] / (wA + wB) Pemisahan yg baik harus mempunyai RS ≥ 1,5, karena hanya 0,3% daerah yg overlap atau pemisahanya mencapai 99,7%. Sedangkan jika RS = 0,75 pemisahannya jelek. RS = 1, berarti daerah A akan mengandung 4% B dan daerah B akan mengandung 4% A.

Pengaruh faktor kapasitas dan selektifitas pada resolusi dari gambar diatas untuk solut A dan solut B, maka resolusinya: Dimana k’B adalah faktor kapasitas dari spesies yg bergerak lebih lambat, α adalah faktor selektifitas. Persamaan tsb dapat diatur dengan menghitung jumlah pelat yg diperlukan untuk pemisahan yg baik.

Pengaruh resolusi pada waktu retensi Kromatografi berhasil dengan baik jika memungkinkan resolusinya paling tinggi dan waktu retensinya singkat. Pengaruh resolusi pada waktu retensi adalah: Dimana µ =kecepatan linier dari fase gerak