Analisa Karbohidrat Dwi Larasatie Nur Fibri, STP, M.Sc Laboratorium Ilmu Pangan dan Gizi Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian Universitas Gadjah Mada

KARBOHIDRAT KARBOHIDRAT (=hydrated carbon) : karbon yg mengikat air secara kimiawi = C + H2O dengan jumlah atom C minimal = 3 Rumus kimia empiris karbohidrat : (CH2O)n atau Cm(H2O)n Monosakarida Manis 3 bentuk KH Oligosakarida Gugus hidroksil Terlalu besar, tidak dapat masuk ke dalam sel-sel kuncup rasa pada permukaan lidah Polisakarida

KLASIFIKASI KARBOHIDRAT berdasar jumlah monomernya Monosakarida Oligosakarida Polisakarida 5-6 karbon sbg rantai atau cincin Punya bbrp gugus hidroksil (-OH) dan satu karbonil (-C=O ) Glukosa Fruktosa Galaktosa 2 – 10 unit monosakarida: Sukrosa Laktosa Maltosa Rafinosa Stakiosa Lebih dari 10 unit monosakarida: Pati Cellulosa Mannan galaktan galaktomannan pektin mannoglukan.

STRUKTUR LINIER Glukosa (Aldosa) Fruktosa (Ketosa) Gugus Aldehid (reduktif) Gugus Keton (reduktif) Glukosa (Aldosa) Fruktosa (Ketosa)

Di alam, 90% karbohidrat merupakan bentuk tertutup, baik pyran maupun furan Pyran 5C 1O (ikatan C1-C5) Furan 4C 1O (ikatan C2-C5) Bentuk ikatan beta tidak tercerna oleh enzim pencernaan Semua monosakarida adalah gula reduksi asalkan C1-nya tidak berikatan dengan gugus lain

Perubahan Glukosa ke bentuk cincin Gugus reduktif

Bentuk Cincin Glukosa dan Fruktosa gugus reduktif Alpha D-glucose Beta- D-fructose Glukosa molekul terbuka Cincin piran Cincin furan

Disakarida Gugus reduktif a1-4 linkage

Gugus reduktif saling menutup (tidak reduktif) Disakarida aGlucose+ Fructose= Sucrose aGlucose+ Galactose=Lactose Gugus reduktif saling menutup (tidak reduktif)

polimer glukosa dengan ikatan  (alfa-) Pati / Amilum Gugus reduktif amilopektin amilosa Glikogen dlm tubuh hewan polimer glukosa dengan ikatan  (alfa-)

Amilosa Amilosa adalah rantai tak bercabang Amilopektin adalah rantai cabang di 1,6 glikosidik Amilosa-amilopektin di alam selalu tercampur dan hanya ada di jaringan tanaman Enzim α 1,4 amilase bisa memecah ikatan 1,6 glikosidik, tapi butuh waktu lebih lama

Amilosa = 200 molekul glukosa Amilopektin = 600 molekul glukosa Selulosa β 1,4 glikosidik  tidak dapat dicerna enzim pencernaan Hewan pemamah biak juga tidak dapat mencerna, tapi lambungnya tidak asam sehingga ada bakteri yang mampu hidup dan menghasilkan enzim selulase

Pati jika dihidrolisis sempurna, Dextrose Equivalen (DE) = 100 Sifat reduksi monosakarida (glukosa) = 100% Berkurang jika berikatan Sukrosa tidak reduktif karena C1 glukosa berikatan dengan C2 fruktosa

Analisa karbohidrat Dlm analisa proksimat, kadangkala tidak dilakukan analisa karbohidrat KH dihitung dari hasil analisa komponen yg lain & dinyatakan sbg KH ‘by difference’ : % KH (wb) = [100 – (air+abu+lipid+prot)]% % KH (db) = [100 – (abu+lipid+protein)]% Kelemahan: Merupakan KH total yg tercerna maupun tidak  tidak menggambarkan nilai gizi sebenarnya Untuk pakan Ok, tapi tidak untuk pangan Bisa untuk pangan yang jelas KH-nya [sayur = serat (KH); pati,beras = amilosa (KH)] Tidak bisa untuk teh, kopi, tembakau karena ada senyawa mayor lain

Analisa karbohidrat 3 analisa, yaitu: Gula sederhana / gula reduksi Pati tercerna Serat Prinsipnya : berdasar pada sifat/daya reduktif gula

Analisis Persiapan sampel : digiling, dihilangkan lipida dan klorofilnya dengan ekstraksi menggunakan eter. Mengekstraksi karbohidrat yang dapat larut dengan air, kemudian dijernihkan dengan timbal asetat Larutan karbohidrat ditentukan dengan : analisis gula reduksi (metoda Luff, atau Nelson), atau enzimatis, atau polarimetri, atau kromatografi

1. Analisa gula reduksi Tujuan menentukan jumlah gula reduksi Prinsip: reduksi kupri-oksida menjadi kupro oksida oleh gula reduksi Metode : Luff-Schrool Nelson-Somogyi

Analisa Gula Reduksi >> Metode Luff-Schrool Prinsip : gula reduksi + kuprisulfat berlebihan dalam larutan alkalis akan menjadi asam gula dan endapan kuprooksida berwarna merah Sisa kuprisulfat untuk mengoksidasi KI menjadi I2 yang kemudian di titrasi menggunakan tiosulfat dengan indikator amilum sampai warna biru hilang Untuk mengetahui kuprisulfat mula-mula maka dilakukan titrasi blanko Selisih titrasi blanko dan sampel = menunjukkan banyaknya kupri yang bereaksi dengan gula, dan banyaknya gula dapat ditentukan berdasarkan tabel yang tersedia. Reaksi : Cu++ + gula red.  Cu2O + asam gula 2 Cu++ + 2 I-  2 Cu+ + I2 I2 + 2 Na2S2O3=  2 NaI + Na2S4O6

Lakukan titrasi blanko dng sampel 25 ml aquadest ! Analisa Gula Reduksi >> Metode Luff-Schrool >> Prosedur Larutan sampel 25 ml yg mengandung + 60mg gula reduksi ditambah 25 ml reagen Luff dipanaskan dlm waterbath mendidih selama 30 menit dan kemudian didinginkan Tambahkan 15 ml lart. KI jenuh kemudian dimasukkan ke dlm ruang gelap 30 menit, tiap 5 menit digoyang sedikit Cairan yg telah berwarna coklat kmd dititrasi dng lart standar Na2S2O3 sampai berwarna kuning muda, tambahkan 2 ml larutan amilum 1%  warna biru  titrasi lagi sehingga warna biru tepat hilang Lakukan titrasi blanko dng sampel 25 ml aquadest !

Analisa Gula Reduksi >> Metode Luff-Schrool >> Kelebihan-Kelemahan Cukup teliti Kurang praktis, waktu lama Kebutuhan reagen kimia banyak  boros biaya /mahal, garam KI murni sangat mahal

Analisa Gula Reduksi >> Metode Luff-Schrool >> Contoh soal Sampel teh botol (lemon tea) diperkirakan mengandung gula reduksi 2-3 % b/v akan diuji dengan analisa Luff-Schrool. Bagaimana cara preparasi (=pengenceran) sampel tsb agar larutan sampel yg akan ditambah reagen Luff mengandung sekitar 50-60 mg gula reduksi per 25 ml ?

Gula reduksi akan dioksidasi oleh kupri-oksida dihasilkan kupro-oksida Analisa Gula Reduksi >> Metode Nelson-Somogyi PRINSIP: Gula reduksi akan dioksidasi oleh kupri-oksida dihasilkan kupro-oksida Kupro-oksida direaksikan dengan arseno-molibdat akan membentuk senyawa kompleks berwarna violet/ungu Intensitas warna ekuivalen dengan kon-sentrasi gula, yang dapat ditera absor-bansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

Analisa Gula Reduksi >> Metode Nelson-Somogyi Untuk mengetahui konsentrasi gula maka perlu dibuat kurva standar yang menggambarkan hubungan konsentrasi gula dengan absorbansi Larutan sampel setelah ditambah reagen Nelson kmd ditera absorbansinya, dan dari nilai A dihitung kadar gulanya menggunakan persamaan garis kurva standar tsb.

Analisa Gula Reduksi >> Metode Nelson-Somogyi Pembuatan Kurva Standar : Kurva standar dipersiapkan dari larutan glukosa murni berkadar 1 mg/10mL yang diisikan ke dalam tabung reaksi sejumlah sbb : No. tabung reaksi 1 2 3 4 5 6 Lart.glukosa (mL) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Aquadest (mL) Volume total (mL) 1,0 Kadar glukosa (mg/100mL) 8 10 Kadar glukosa ( g/mL) 20 40 60 80 100

Analisa Gula Reduksi >> Metode Nelson-Somogyi ·      Tambahkan ke dalam masing-masing tabung tsb 1 mL reagensia Nelson, panaskan semua tabung pada waterbath mendidih selama 20 menit ·      Ambil semua tabung, dinginkan bersama-sama dalam air sampai 25oC, kemudian masing-masing ditambah 1 mL reagensia Arseno-molibdat, gojog sampai semua endapan larut kembali, kemudian masing-masing tabung ditambah 3 mL aquadest, gojog sampai homogen ·      Ukurlah ‘optical density’ atau ‘absorbansi’-nya pada 540 nm dan tabulasikan hasil pembacaan sbb :

No X (kadar gula) Y (absorbansi) X2 Y2 XY 1 0 = X1 Y1 X12 Y12 X1Y1 2 2 = X2 X22 Y22 X2Y2 3 4 = X3 Y3 X32 Y32 X3Y3 4 6 = X4 Y4 X42 Y42 X4Y4 5 8 = X5 Y5 X52 Y52 X5Y5 6 10 = X6 Y6 X62 Y62 X6Y6 n  x  y  x2  y2  xy

Dimana : b = [ nxy - xy ] / [ nx2 – (x)2 ] a = [ y – b  x ] / n ·      Persamaan kurva standar linier : Y = a + bX Dimana : b = [ nxy - xy ] / [ nx2 – (x)2 ] a = [ y – b  x ] / n [ nxy - xy ] [nx2 –(x)2]1/2 [ny2 – (y)2]1/2 Dengan koefisien r = regresi Koefisien regresi (r) sebaiknya dihitung dahulu apakah sudah memenuhi, misalnya minimal 95% (= 0.95) !! Baru kemudian dihitung nilai parameter (b) dan (a) * Persamaan garis linier Y = a + bX kemudian di plot ke bentuk kurva seperti Gambar berikut :

Y Absorbansi Y = a + bX Ys Xs Konsentrasi (mg/100mL) X · Pengukuran absorbansi larutan sampel encer setelah direaksikan dng reagensia Nelson  hasilnya A = Ys selanjutnya di plot ke kurva tsb dan akan diperoleh nilai konsentrasi gula = Xs atau langsung dimasukkan ke persamaan Y = a + bX  diperoleh nilai konsentrasi gulanya . Sampel yang akan dianalisis gula reduksinya harus diencerkan sampai kadar gulanya masuk dalam kisaran kadar gula kurva baku (dalam contoh di atas antara 0 – 10 mg/100 mL, atau lebih baik lagi antara 4 – 8 mg/100mL)

Contoh : akan dianalisa kadar glukosa dari serbuk glukosa yang diperkirakan kadarnya sekitar 90% . sampel tsb dipersiapkan sbb : *Ditimbang 0.1 gr serbuk/kristal glukosa dan dilarutkan jadi 50mL  Dipipet 3mL larutan tsb dan diencerkan menjadi 100mL  akan diperoleh lartan glukosa dengan kadar sekitar = (3/100) x (0.9)100mg/50mL ~ + 2.7 mg/50 mL atau + 5.4 mg/100 mL · *Dipipet larutan glukosa encer tsb 1 mL ditambah 1 mL reagensia Nelson dan selanjutnya diperlakukan sama seperti pada prosedur di atas. Hasil pembacaan absorbansinya dimasukkan ke persamaan kurva standar  diperoleh kadar gula reduksi-nya.

Contoh : akan dianalisa kadar gula madu yg diduga berkadar air 27% dan berkadar gula + 67%  dapat kita siapkan sbb : ditimbang + 1 gr madu dan diencerkan dng air  25 mL(lart.A); kmd dipipet 1 mL lartn (A) dan diencerkan  25 mL(lart.B); kmd dipipet 1 mL lartn (B) dan diencerkan menjadi 25 mL (= lartn C) Akan diperoleh larutan madu (C) dng kadar gula sekitar = (1/25)x(1/25) x 670 mg = +1.072 mg/25 mL atau +4,29 mg/100 mL

Penentuan Sukrosa C6H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6 Sukrosa dihidrolisis dengan asam atau enzim Menghasilkan 2 mol gula reduksi/ gula invert (fruktosa dan glukosa) Gula invert ditentukan dengan metoda Luff atau Nelson C6H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6 Sukrosa BM = 342 Fruktosa BM = 180 Glukosa

Kadar sukrosa = Jml gula reduksi x FK FK = BM sukrosa = 342 = 0.95 Penentuan Sukrosa Perhitungan : Kadar sukrosa = Jml gula reduksi x FK FK = BM sukrosa = 342 = 0.95 2 BM gula red 2 x 180

Penentuan pati PRINSIP: Pati dihidrolisa dengan asam sehingga menghasilkan gula-gula reduksi, kemudian gula yang terbentuk ditetapkan jumlahnya. (C6H10O5)m + m H2O m C6H12O6 Pati m Glukosa BM = 162 m BM = 180 m Faktor konversi = BM pati BM Gula reduksi Kadar pati = FK x kadar gula reduksi

Pengolahan Data

No X (kadar gula) mg/100ml Y (absorbansi) X2 Y2 XY 1 0.21 0.0441 2 0.12 4 0.0144 0.24 3 0.31 14 0.0961 1.24 6 0.65 36 0.4225 3.9 5 8 0.62 64 0.3844 4.96 10 0.81 100 0.6561 8.1 30 2.72 218 1.6176 18.44 n = 6 ; ∑ x = 30 ; ∑ y = 2,72 ; ∑ x2 = 218 ; ∑ y2 = 1,6176 ; ∑ xy = 18.44

r = [nx2 –(x)2]1/2 [ny2 – (y)2]1/2 n = 6 ; ∑ x = 30 ; ∑ y = 2,72 ; ∑ x2 = 218 ; ∑ y2 = 1,6176 ; ∑ xy = 18.44 ·      Persamaan kurva standar linier : Y = a + bX Dimana : b = [ nxy - xy ] / [ nx2 – (x)2 ] a = [ y – b  x ] / n [ nxy - xy ] [nx2 –(x)2]1/2 [ny2 – (y)2]1/2 r = r = (6x18,44 – 30x2,72)/[6x218 – (30)2]1/2 [6x1,6175-(2,72)2]1/2 = (110,062– 81,6)/[20.199x1.51875] = 28,462/30,6772 = 0.9279 Koefisien regresi tsb belum memenuhi syarat bila dipathok nilai minimal 95% atau > 0,95  Data perlu direvisi, misal data no.4 dihilangkan !?!

Misalkan kita inginkan persamaan garis dng probabilitas error rendah katakan < 5% berarti nilai r > 0,95 . Apabila misalnya kita dptkn nilai terhitung r < 0,90 berarti error > 10% Pada keadaan tsb data pembacaan absorbansi di lihat apakah ada yng bisa dibuang karena terlalu menyimpang, selanjutnya dihitung ulang semua nilai n; ∑x; ∑y; ∑x2; ∑y2; dan ∑xy serta nilai koefisien r . Bila nilai (r) telah mencapai 0,95 atau lebih, baru dihitung nilai (a) dan (b) Misal data sebelumnya dihilangkan pada pembacaan dari tabung no. 4  Tabel data berubah sbb :

No X (kadar gula) mg/100ml Y (absorbansi) X2 Y2 XY 1 0.21 0.0441 2 0.12 4 0.0144 0.24 3 0.31 14 0.0961 1.24 6 0,65 36 0,4225 3,90 54 8 0.62 64 0.3844 4.96 65 10 0.81 100 0.6561 8.1 6  5 24 2.07 182 1.1951 14.54 n = 5 ; ∑ x = 24 ; ∑ y = 2,07 ; ∑ x2 = 182 ; ∑ y2 = 1,1951 ; ∑ xy = 14.54

r = [nx2 –(x)2]1/2 [ny2 – (y)2]1/2 n = 5 ; ∑ x = 24 ; ∑ y = 2,07 ; ∑ x2 = 182 ; ∑ y2 = 1,1951 ; ∑ xy = 14.54 ·      Persamaan kurva standar linier : Y = a + bX Dimana : b = [ nxy - xy ] / [ nx2 – (x)2 ] a = [ y – b  x ] / n [ nxy - xy ] [nx2 –(x)2]1/2 [ny2 – (y)2]1/2 r = r = (5x14,54 – 24x2,07)/[5x182 – (24)2]1/2 [5x1,1951-(2,07)2]1/2 = (72,7– 49,8)/[18.2757x1.30023] = 22,9/23,7626 = 0.9637 !!! b = [5*14,54 – 24*2,07]/[5*182 –(24)2] =23,02 / 334 = 0,068922 a = [2,07 – 0,068922*24]/5 = 0,415872 / 5 = 0,0831744 Persamaan garis linier : Y = 0,0831744 + 0,068922 X

Contoh soal pengenceran Diambil 2 gr sampel, dilarutkan menjadi 50 ml (lar. A) Kemudian dari lar. A diambil 2,5 ml dan diencerkan menjadi 25 ml (lar. B) Dari lar. B diambil 2,5 ml dan diencerkan menjadi 25 ml (lar. C) Dari lar. C diambil 1 ml dan diencerkan menjadi 10 ml (lar. D) Berapakah faktor pengencerannya?

Contoh soal penentuan kadar kh Dari lar. D diambil 1 ml dan dianalisa kadar gulanya. Diketahui mengandung 3,5 mg/100 ml Berapakah kadar gula pada sampel? ... mg/g ... %

Contoh soal Tepung beras halus ditimbang 0.3498 gr kmd dihidrolisis dgn HCl  dijernihkan dan volume larutan dijadikan 100 ml (=A) Dipipet 5 ml lart. A dan diencerkan menjadi 200 ml (=B) Dipipet 1 ml lart. B dan diencerkan menjadi 100 ml (=C) Dipipet 1 ml lart. C dan direaksikan dengan reagen nelson somogyi dan dibaca absobansinya A= 0.41 Bila dianalisis terhadap glukosa murni menghasilkan kurva standar A=0.9560 - 0.9482 c (c=kadar glukosa µg/ml) Hitung kadar pati tersebut!