EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE By: Irma Sarita Rahmawati, M.Sc.

EKSTRAKSI ENZIM AMILASE Amilase bekerja pada pati, glikogen dan turunan polisakarida dengan menghidrolisa ikatan  - 1,4 – dan /  - 1,6 - glikosidik Enzim amilase dalam kecambah termasuk enzim endoselluler sehingga untuk mengekstraksi terlebih dahulu harus menghancurkan biji kecambah

Alfa Amilase ( -1,4 glukan glukanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) memecah pati secara acak dari tengah atau dari bagian dalam molekul, karena itu disebut endoamilase Pemecahan oleh  - amilase pada amilosa terdiri atas 2 tahap: Tahap degradasi cepat yang menghasilkan maltotriosa dan maltosa Pemecahan tahap pertama ini ditandai dengan penurunan viskositas yang cepat dan hilangnya kemampuan pewarnaan iodin terhadap amilosa Tahap degradasi lambat terhadap oligosakarida menghasilkan glukosa dan maltosa

Beta– Amilase (- 1,4- glukan malto hidrolase, EC. 3.2.1.2) Enzim  amilase bekerja pada substrat dari gugus terminal non-reduktif, pada ikatan glikosidis kedua dari ujung tersebut. Pada substrat amilosa, bila aktivitasnya tinggi dapat menghidrolisis sempurna menghasilkan maltosa. Pada substrat amilopektin akan menghasilkan maltosa dan sisa dekstrin BM- tinggi.

Glukoamilase Memecah pati dari luar dengan mengeluarkan unit- unit glukosa dari ujung non reduksi polimer pati. Hasil reaksinya hanya glukosa, sehingga dapat dibedakan dengan  dan  amilase. Secara komersial diproduksi dari Aspergillus, Rhizopus. Glukoamilase dapat memecah ikatan -1,3 dan - 1,4. Dengan pengaruh enzim glukoamilase posisi glukosa  dapat diubah menjadi , pH optimum 4-5 suhu 50-60C.

biji direndam semalam ( 12 jam) biji dikecambahkan (12 jam) Tujuan Mengisolasi enzim amilase dari kecambah kacang hijau.   Bahan: biji kering biji direndam semalam ( 12 jam) biji dikecambahkan (12 jam) biji dikecambahkan 24 jam biji dikecambahkan 48 jam buffer asetat (0.1-0.5 M) pH 5.5 pati 4 % pati 1 % iodin 1 % glukosa anhidrat reagen nelson reagen arsenomolibdat

Alat: Mortar Kertas saring sentrifuse Karet hisap Pipet volume 1 ml Tabung reaksi Rak tabung reaksi waterbath Spektrofotometer kuvet beker glass 250 ml

Hancurkan 5 g kecambah biji tambahkan 5 ml buffer asetat (0.1 – 0.5 M) pH 5.5; biarkan selama  30 menit sambil kadangkala diaduk Saring dengan kertas saring Whatman, filtratnya merupakan larutan enzim kasar. Sentrifugasi 1500 rpm selama 30 menit. Ambil supernatannya untuk uji aktivitas

PENGUJIAN KUALITATIF ENZIM AMILASE Parameter umum yang digunakan untuk mempelajari aktivitas hidrolitik enzim amilase terhadap substrat pati diantaranya : Penurunan viskositas Kehilangan kemampuan untuk memberikan warna biru dengan iodin

Bahan Pati 4% (DE=15-20) sebagai substrat Buffer asetat sebagai pelarut substrat Larutan iodin 1% sebagai indikator reaksi Ekstrak kasar amilase   Alat Tabung reaksi Pipet mikro

Substrat yang digunakan larutan pati 4% (DE= 15-20) dengan pelarutnya buffer asetat pH 5.5. 1 ml substrat ditambah larutan iodin 1% tambahkan dengan 0.5 ml larutan enzim. Amati perubahan warna biru dari pati setelah ditambah larutan iodin 1%. Inkubasi pada suhu kamar dengan pengamatan setiap 10 menit, selama 60 menit.

Waktu (menit) Sampel 10 20 30 40 50 60 Biji kering Biji direndam Kecambah umur 12 jam Kecambah umur 24 jam Kecambah umur 36 jam