AFLATOKSIN dan BAHAN PENGAWET

AFLATOKSIN Senyawa metabolik sekunder yang bersifat toksik dan karsinogenik Dihasilkan: Aspergilus flavus & Aspergilus parasiticus Keduanya tumbuh pada biji-bijian, kacang-kacangan, padi-padian. Ada beberapa jenis Aflatoksin : B1, B2, G1 dan G2. Dapat diproduksi oleh kedua jamur tersebut baik selama tanaman sedang tumbuh, dipanen maupun dalam penyimpanan. Aflatoksin B1  toksis dan karsinogenik terhadap binatang dan manusia Tikus yang diberi makanan yang mengandung 2ppb aflatoksin dalam waktu lama  tumor pada hati.

PENENTUAN AFLATOKSIN HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (High Performance Liquid Chromatography) Kolom  waktu refensi Fase stasioner Fase mobil  elusi Injeksi Detektor Kromatogram Standar

Penentuan aflatoksin dengan HPLC Alat : Kromatografi dilengkapi 2 pompa dan kolom berukuran 250 x 4,6 mm, 5 m Supelco, fase reversi C18, Guard column dengan isian 2 m (Rheodyne Model 7125 dengan 50 l loop) yang diletakkan antara injektor dan kolom Detektorfluoresen Fase mobil = air : metanol = asetonitril 50 : 40 : 10 laju alir 0,8 ml/menit Koil reaktor berukuran 5000 x 0,3 mm untuk derivatisasi

Penentuan aflatoksin dengan HPLC Cara ekstraksi : 50 g sampel + 59 NaCl + 140 ml metanol : air (70 : 30) blender dengan kecepatan tinggi. Saring ekstraknya dengan kertas saring whatman 12 ml ekstrak + 30 ml air deionisasi (agar konsentrasi metanol akhir = 20%) Ekstrak encer yang mengandung 1 g sampel dialirkan melalui affinity column untuk pemurnian afltoksin Cuci affinity column 1 x dengan 10 ml air deionisasi Aflatoksin dikeluarkan dari kolom dengan pencucian menggunakan 1 ml metanol

Kondisi kromatograf : Alat HPLC Kolom Shodex R Spak DS – 613 10 l atiquod sampel injeksikan dalam kolom Zat pengawet dielusi se c isokratis dengan kecepatan 1,0 ml/menit Deteksi dengan UV spektrometri pada  = 230 nm (kompromi untuk  macam pengawet) Kuantitatif : puncak zat pengawet dibandingkan dengan standar

Penentuan zat pengawet dalam minuman dengan HPLC asam benzoat asam sorbat paraben  sering dicampur Na-benzoat Penentuan zat pengawet dalam minuman dengan HPLC Reagensia : Larutan standar 0,1% dibuat dengan melarutkan 1 g dalam 200 ml metanol  encerkan sp 1 l dengan air deionisasi. Fase mobil : 0,05 MKH2PO4 (pH 2,65) dan asetonitril 60 : 40 (v/v), saring melalui Duropore filter ukuran 0,45 m, hilangkan gas dengan sonikasi.

Preparasi Sampel : - Sentrifus sampel dalam tabung sentrifus 50 ml pada 1500 rpm selama 6,5 menit - Kolom C18 kartrij dielusi dengan 2 ml metanol kemudian dengan 4 ml air. - 2 ml supernatan injeksikan melalui kartrij yang telah disiapkan. - Cuci kartrij dengan 0,4 ml heksana, elusi zat pengawet dengan 3 ml metanol, saring melalui Duropore - Ekstrak metanol diuapkan  0,5 ml dengan aliran gas N2  encerkan menjadi 1 ml dengan air deionisasi  siap diinjeksikan

Dengan kromatografi kolom kaca p = 150 mm d = 8 mm diisi dengan florisil (100 – 200 mesh) 15 mm dibagian bawah dan 15 mm bagian atas dengan alumina netral yang tidak mempunyai daya fluoresensi bagian atas dan bawah dibatasi wol kaca/pulp kertas.  Untuk okhratoksin A kolom ukuran sama tetapi diisi dengan 60 mm florisil. Reagensia : Zat pelarut untuk ekstraksi : metanol : air (8 : 2 v/v). Larutan penjernih, 150 g Zn SO4 dan 50 g asam fosfotungtat dilarutkan dalam 1000 ml aquadest. Larutan heksan : aseton (8 : 2 v/v). Benzen. Metil alkohol H2SO4 0,25 N

Prosedur : Sampel (kacang tanah) haluskan 1’ dengan blender. + metanol – air, blender 1’, biji-bijian berminyak blender 2’ sampel : pelarut = 1 : 2. Saring dengan kertas saring (15 ml ekstrak). + 15 ml larutan pembersih, gojog. Saring 15 ml campur melalui fiber glass. + 3 ml benzen, gojog, diamkan  pemisah  ambil 1 ml bagian atas  masukkan ke dalam mini kolom, isap dengan vakum pada bagian bawah kolom. + 5 ml heksan – asetan, keluarkan, 2’ Aflatoksin  band (garis) biru berfluoresensi di bawah sinar UV gelombang panjang (minimal 4 ppt) Untuk okhratoksin A, 1 ml larutan benzen pada lapisan atas  masukkan mini kolom untuk aflatoksin  isap dengan vakum. + 3 ml metil alkohol (metanol)  isap dengan vakum 15 – 20’ Lepas vakumnya + 0,3 ml H2SO4 0,25 N Segera lihat kolom dengan sinar UV Okhratoksin  warna biru berfluoresensi kira-kira 1 cm dari bagian atas kolom  beras, jagung, kacang :  8 ppb  gandum/sorghun :  16 ppm

Penentuan bahan pengawet  Asam benzoat (kualitatif) Ambil sampel + 4 bagian air, aduk, saring Ambil  50 – 100 ml larutan + H2SO4 encer (4 N), gojog 2 x dengan 20 dan 10 ml ether  uapkan larutan etheris dengan pemanasan lambat. Residu + 10 ml H2SO4 (p) atau 1 tetes HNO3 berasap (HNO3 65%) atau 50 mg KNO3, panaskan 180oC, 3’ Setelah dingin + (NH4) sS atau 40 mg hidroksilamin  warna merah coklat : asam benzoat.