PENGANTAR BIOTEKNOLOGI IKAN DR. YUNI KILAWATI,S.PI.,M.SI PENGANTAR BIOTEKNOLOGI IKAN

Amerika Serikat mengijinkan digunakannya sel tubuh manusia untuk kegiatan penelitian mengenai terapi gen. 1990 Metode polymerase chain reaction (PCR) pertama kali dipublikasikan 1988 Badan paten Amerika Serikat mengumkan bahwa tikus yang direkayasa secara genetis peka terhadap kanker Ti plasmid yang telah direkayasa digunakan untuk transformasi pada tanaman 1983 Pertama kalinya vaksin hewan diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan di Eropa 1982 Pertama kalinya kit diagnostik yang dibuat dari antibodi monoklonal digunakan secara luas di Amerika Serikat 1981 Pertama kalinya alat otomatis untuk sintesis DNA dijual secara komersial Badan pengadilan Amerika Serikat menetapkan peraturan dalam kasus Diamond VS Chakrabarty yang melakukan manipulasi mikroorganisme yang dipatenkan. 1980 Perusahaan Genentech memproduksi insulin manusia pada sel bakteri Escherichia coli 1978 Pengembangan teknik untuk mengetahui sekuen DNA 1976 Pertama kali dikeluarkan pedoman untuk penelitian dalam bidang DNA rekombinan Kohler dan Milstein mendeskripsikan produksi antibodi monoklonal 1975 Boyer dan Cohen mengembangkan teknologi DNA rekombinan 1973 Khorana dan rekan-rekannya dapat mensintesis keseluruhan gen yang mengkode tRNA 1972 Isolasi pertama kali enzim endonuklease restriksi 1970 Keseluruhan kode genetik dapat diketahui 1961-1966 Watson dan Crick menemukan struktur DNA 1953 Avery, MacLeod dan McCarty membuktikan bahwa DNA merupakan materi genetik. 1944 Antibiotik penisilin diproduksi besar-besaran dalam skala industri 1943 Karl Ereky pertama kali menyatakan istilah bioteknologi 1917 Peristiwa Tahun

PETA KONSEP Kelangsungan Hidup Manusia Ditunjang Oleh Teknologi melalui Bioteknologi Bioteknologi Konvensional Bioteknologi Modern Produksi Misalnya Tempe Kecap Keju mikroprotein Kultur Jaringan Rekayasa Genetik

Bioteknologi Kelautan dan Akuakultur Bioteknologi dalam bidang kelautan/akuakultur dapat dimanfaatkan untuk memproduksi dan mengembangkan: Farmasi Enzim dan bahan-bahan biomolekul Biopestisida Peningkatan pertumbuhan, perkembangan, reproduksi dan nutrisi ikan 19

Bioteknologi Lingkungan Bioteknologi dapat dimanfaatkan untuk mengatasi isu lingkungan seperti: Restorasi ekologi Diagnosis dan monitoring penyakit menular Kontrol hama,penyakit dan gulma pada pertanian Deteksi, monitor dan remediasi polutan Skreening toksisitas Konversi limbah ke energi 20

Bioteknologi Perikanan Pembuatan ikan Triploid dan Monosex Diagnosa penyakit lebih akurat, cepat dan murah lewat Biologi Molekular Pembuatan Vaccine ikan Penciptaan ikan yang resisten penyakit Penciptaan ikan dengan pertumbuhan cepat Penciptaan ikan yang tahan pada suhu dingin dll

Bioteknologi dan Aquaculture Aquaculture merupakan industri yang berkembang pesat Pemenuhan kebutuhan pangan dunia dan pertimbangan kesehatan membuat permintaan akan produk perikanan meningkat Permasalahan dalam budidaya : pertumbuhan lambat, penyakit, limbah budidaya merupakan hal yang harus diatasi Bioteknologi mampu mengatasi berbagai problem BD dan meningkatkan produksi

Siklus pada Budidaya Perairan

Permasalahan Penyiapan induk udang berkualitas unggul  usaha domestikasi & perbaikan mutu genetik udang ( terprogram & berkesinambungan) Permasalahan pada induk introduksi adalah keterbatasan jumlah induk  menurunkan keragaman genetik benih turunannya, apalagi dengan dilakukannya pemijahan berulang di hatchery (Haryanti et al., 2004). Induk introduksi juga tidak diketahui turunan ke berapa dalam proses seleksinyainduk introduksi merupakan hasil klon melalui rekayasa genetik  homozigositas yang tinggi antar induk.

Kondisi diperburuk dengan pembuatan induk lokal tanpa pemantauan mutu genetiknyamenyebabkan tereduksinya keragaman genetik & inbreeding. Akibat perlahan namun pasti  diperoleh induk-induk udang dg mutu yang rendah secara genetik. Usaha menghasilkan induk dg kriteria resisten terhadap penyakit tertentu memerlukan waktu & biaya yang tinggidiperlukan usaha mendapatkan informasi mengenai marka genetik sebagai salah satu dasar seleksi individu agar bisa diperoleh induk & benih udang yang baik secara fenotip dan genotip.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) teknik yang digunakan untuk membedakan organisme yang mempunyai perbedaan sekuensi DNA homolog yang dapat dideteksi oleh adanya perbedaan panjang fragment setelah DNA dipotong oleh enzim restriction endonucleases tertentu.

Penggunaan PCR yang dikombinasikan dengan pengggunaan enzim restriksi dan RFLP untuk mengidentifikasi berbagai species udang telah dilakukan dengan cukup tepat dan efektif. Analisis fragment restriksi cukup sensitif untuk membedakan antara dua alel dari gen yang dilihat dari pasangan basa dalam restriction site.

2. Ekstraksi DNA Mengambil sample (kaki renang) Menyimpan pada suhu -8 oC atau langsung diekstraksi sample dihancurkan dalam tabung mikro yang berisi 200 ul 10 % chelex-100 dalam buffer TE pH 8 Menambahkan 5 ul proteinase K (200mg/l) Memanaskan dalam thermoblock 55 oC, 2,5 – 3 jam Kembali memanaskan dalam thermoblock 89oC, 8 menit Mendinginkan pada suhu kamar (hingga dingin) Menyentrifuge 13.000 rpm, 5’, 4oC Mentransfer supernatant ke tabung mikro baru Menyimpan pada suhu -20oC atau diproses lebih lanjut

2. Purifikasi Suspensi (50 µl genom) ditambahkan 1,33 ul RNAase dan dicampur perlahan lalu diinkubasi dalam wadah waterbath pada suhu 37 o C 15 menit Menambah 6,67 ul 1 % SDS kemudian diinkubasi dalam waterbath 70o c 10 ‘ Menambah 58,3 ul fenol kemudian disentrifuse pada 12.000 rpm, 4o C, 5 ‘ Supernatan diambil dengan hati-hati kemudian ditambahkan Sodium Asetat pH 5,5 ; 6,7 ul (dipipeting) Menambahkan 133,3 ml etanol absolute, didiamkan selama 10 ‘ pada suhu kamar Menyentrifuse pada 12.500 rpm 10 ‘ Supernatan dibuang, pellet diresuspensi ulang dengan 100 ul etanol 75 %  etanol dibiarkan menguap 5 – 10 ‘ (di buang pelan-pelan, dibalik dan diserap mgnk tissue) Pelet ditambah 133,3 ul TE  disimpan pada suhu 4 o C utk selanjutnya diukur pada elektroforesis (OD 260 & OD 280) utk menghitung kemurnian DNA

PCR Rflp dengan primer : 1. P.monodon: 16S rRNA 2. L.Vannamei : COI-COII

PCR cocktail : 1. Genome 2,5 µl 2. H2O 11 µl 3. 10 x buffer 2,625 µl 4. dNTP 2,625 µl 5. COI 0,625 µl 6. COII 0,625 µl 7. MgCl2 5,25 µl 8. Taq 0,25 µl Total 25 µl

dimasukkan ke dalam mesin PCR thermocycler ; Initial denaturation - Denaturation 94oC, 1 min Annealing 55oC, 1 min Extension 72oC, 1 min Cycles 40x Final extension 72oC, 5 min Soak temperature 4 oC, 

PCR produk diambil sebanyak 5 µl dan dicampur dengan loading dye 1 µl dimasukkan kedalam sumuran gel agarose 1 % dengan TBE buffer 1x untuk mengetahui pita tunggal amplifikasi dari template DNA mitokondria. Pengamatan menggunakan elektroforesis selama kurang lebih 20 menit, voltase 170 Watt. Marker yang digunakan adalah DNA ladder 100 bp.

Setelah itu baru dilakukan pemotongan band tunggal dengan menggunakan enzim restriksi, sebagai berikut : P.monodon: Hinf I, Hae III, Hind III, Nde II, Bam HI L.vannamei: Nla III, Hha I

Hae III H2O 1 µl NE2 0,5 µl RE 0,5 µl Jumlah 2 µl PCR product 4,0 µl Incubate 37 oC, 3.5 H  

Hha I H2O 0,48 µl NE4 1,2 µl BSA 0,12 µl RE 0,2 µl Jumlah 2 µl PCR product 3,0 µl Incubate 37 oC, 3.5 H  

Nla III H2O 0,48 µl NE4 1,2 µl BSA 0,12 µl RE 0,2 µl Jumlah 2 µl PCR product 3,0 µl Incubate 37 oC, 3.5 H

Untuk melarutkan primer pada umumnya dipergunakan buffer pH 8 atau dd H2O tergantung pada instruksi dari merk produk primer, cara pembuatan 10 mM primer : COIH 10 µl primer solution (100 mM) + 90 µl TE buffer (sentrifuse 5000 RPM, 5 min) COIL  

Electrophoresis : 10 µl bhn DNA yg sdh diamplifikasi  campur dg 6 x loading buffer 2 ul  masukkan 10 ul ke sumur pada agarose gel  alirkan listrik 100 v (25 menit)  staining dlm buffer yg mgd ethidium bromide 0,05 %

Staining dan pengamatan hasil :  100 ml buffer staining + 5 ul Ethidium bromide (0,05 % v/w)  masukkan gel yang telah dielektroforesis kedalamnya rendam selama 15 menit amati pada transilluminator Penentuan karakteristik mt-DNA

TERIMAKASIH