IDENTIFIKASI BERCAK SPERMA MELALUI ANALISA DNA PROFILING DAN MEMBANDINGKAN DENGAN DARAH TERSANGKA PADA LOCUS THO1,D17S5 & vWA Ahmad yudianto,dr AHMAD YUDIANTO,dr

PENDAHULUAN Kejahatan sex Pembuktian adanya sperma. Sperma  cairan & Bercak. Tes Dx : UV, Pengecatan & Kimiawi Sejak 1985 dikembangkan DNA

TINJAUAN PUSTAKA (1) BIOMOLEKULER SPERMATOZOA. Ejakulat pria  SEMEN (cair & padat). Bag. Padat semen  spermatozoa o/ TESTIS. 4 Porsi Ejakulat : Pre-Ejakulat, Awal, Utama & Akhir. Normal : 2-3 ml (Spermatozoa 60-80 juta/ml). Zat yg t’kandung : Fruktosa, PG, Elektrolit, Enzim, Hormon, aa, KH & lemak.

TINJAUAN PUSTAKA (2) Bagian Spermatozoa : Kepala, leher & Ekor (panjang 50 um). Kepala 1 inti DNA Kepala Spermatozoa leher Middle piece

TINJAUAN PUSTAKA (3) Kadar DNA dlm jaringan Tubuh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 SUMBER KADAR DNA 1 Cairan Amnion 65 ng/ml 2 Darah 40 ug/ml 3 CVS 8 ug/ml 4 Biakan Fibroblast 6,5 ug/T25 Flask 5 Rambut 250 ng/mg 6 Hepar 15 ug/mg 7 Otot 3 ug/mg 8 Kulit 9 Sperma 3,3 pg/sel

TINJAUAN PUSTAKA (4) Dasar pemeriksaan DNA daerah Intron. DNA untaian double helixik. Hidrogen. Btk untaian A-E & Z, B >> ok.fisiologis. Monomer Nukleotida : Basa, gula & P. Basa : A & G (purin), C & T (pirimidin) Ikatan G-C lebih stabil.

Ikatan Fosfadiester 3’-5’ TINJAUAN PUSTAKA (5) Basa N Ikatan Glikosidik Gula/Deoksiribosa Ikatan Fosfadiester 3’-5’ Phospat Ikatan hidrogen Double Helix Struktur DNA Struktur kimia DNA sama setiap org tp urutan basa beda. Pola pengulangan deretan basa DNA Teknik analisa : RFLP, VNTR, STR & mt DNA FBI : 13 locus STR

TINJAUAN PUSTAKA (6) 2. PENANGANAN SAMPEL. Penanganan Sampel : sangat penting. Penyimpanan : Sbg Ekstraksi, Lysate jar & DNA murni. Sampel sperma : - cair dihisap, bercak dikain yg dicurigai. - dibungkus & label legal artis. - kirim ke lab.

TINJAUAN PUSTAKA (7) 3. TAHAPAN PEMERIKSAAN 3.1.Isolasi DNA : - Tahapan : lisis buffer, digestion & proteinase K. - Metode : Chelex, Trizol, Wizard, phenol & salting out. - Trizol : pasti berhasil, pendek, tahan lama & DNA paling tinggi.

Metode TRIZOL : - Cairan darah : = 1 ml trizol + 0,5 ul drh EDTA, vortex, ink.5’. = 0,2 ml chloroform, vortex ink.3’ = centrifg. 16000 rpm.15’.4 C, ambil fs atas. = +0,5 ul isopropanol, ink. Sh kamar 10’ = centrfg 16000 rpm 10’,4 C = Buang supernatan, cuci dgn alkohol 70%. = + dgn DW 50 ul, simpan. - Bercak : = 3 ml DW + kain bercak (simp 1 hr). = sonicasi 15’, vortex (homogen), ambil cairan centrfg 6000 rpm 20’, pellet diambil.

Analisa Elektroforesa TINJAUAN PUSTAKA ( 8) 3.2. PEMURNIAN & KADAR DNA Analisa Kemurnian DNA : UV Sphectrophotometri & analisa elektroforesa pd agarose gel berisi 0,5 ug/ml EtBr. EtBr Analisa Elektroforesa UV Spectrophotometri

Prosedur UV Sphectrophotometri : DW 295 ul + DNA Isolasi 5 ul, vortex Baca hasil l 260 & 280 Kadar : l 260 X 700/5 X 50 ul/ml 1 OD = 50 ug/ul Kemurnian : l 260/l 280 Nilai : 1 - 2

TINJAUAN PUSTAKA (9) 3.3. PCR Siklus : DENATURASI, ANNEALING & PERPANJANGAN RANTAI. BAHAN/REAGEN: DNA target, Primer (up Steam, Down steam), PCR mix (tag polimerase, MgCl2, dNTP), DW & mineral oil.

Sintesa dimulai ujung 3’ Prosedur PCR: - Kontaminasi min. - reagen vortex, spin - PCR mix 12,5 ul, primer @2,5 ul pd dinding, vortex, spin. - + DNA target, DW smp total 25 ul. - mineral oil 1-2 tts - amplifikasi PCR, sesuai program/lokus. - lengkap simpan ( 4C) primer primer Sintesa dimulai ujung 3’ Siklus 2

TINJAUAN PUSTAKA (10) 3.4. ELEKTROFORESIS DNA muatan (–) Bergrk ke (+) tgt BM/fragmen. BM<<- makin cepat pd molekul gel (agarose, poliacrilamid & campuran ). Agarose gel Pita DNA

Poliacrilamid agarose composit gel : - Agarose 0,15 gr + 30 cc TBE, dioven sampai homogen (tab.1). - Acrilamid Bis 4,5 cc + Temed 15 ul (tab.2) - Pd Tab.1 pd suhu 50 C + APS 100 ul, tuangkan bolak-balik ke tab.2 & tuangkan ke ELP.

Prosedur Elektroforesa : - DNA Primer & sampel, vortex. - teteskan 2,5 ul loading dye + DNA primer & DNA sampel pada lubang pantray. - Hubungkan terminal elektroda

TINJAUAN PUSTAKA (11) 3.5. STAINING - Silver Staining dari poliacrilamid composite gel. - Silver staining : pemindahan gel dari gel box ke pantray yg diberi berbagai cairan utk menampilkan pita. - Silver staining  murah, cepat & tahan lama.

Prosedur Staining : - Drying : metanol 20%, glycerol 2% dlm 100 cc H20 selama 5’ - Fixaxi : etanol 10%, acetid acid glycerol 5% dlm 100cc H2O selama 20’ - Bilas H2O 3X. -Staining : AgNO3 0,1% dlm 100cc 50-80’, cuci DW 3X. - Developing : NaOH 1,5%, formalin 100ul dlm 100 ccH2O, lihat dilampu

PELAKSANAAN KEGIATAN (1) Kegiatan di TDC UNAIR Des 04-Jan 05. Sampel : Bercak sperma & darah Isolasi DNA  TRIZOL. Sampel darah 4 3 2 5 1 2 3 1 Bercak Sperma Isolasi DNA Metode Trizol Bercak Sperma & Sampel darah Pipet Eppendroff

PELAKSANAAN KEGIATAN (2) -Kemurnian & Kadar DNA - Darah : 1,21 & kadar 483 ng/ul - Bercak : 1,1 & kadar 245 ng/ul Isolasi DNA Jenis Tabung Alat Sphectophotometri

PELAKSANAAN KEGIATAN (3) PCR ELEKTROFORESIS & STAINING MJ Cycler KUTUB POSITIF Staining Fase Develop KUTUB NEGATIF ELP

PELAKSANAAN KEGIATAN (4) Hasil Pemeriksaan: loc. THO1 loc. D17S5 D1 D2 Y1 Y2 M D1 D2 Y1 Y2 203 bp 179 bp

PELAKSANAAN KEGIATAN (5) Hasil Pemeriksaan : Locus Alele Bercak Sperma Alele Sampel Darah Keterangan THO1 11.11 Identik vWA 13.13 D17S5 4.7

KESIMPULAN 1.Tahapan Pemeriksan DNA: ISOLASI DNA, Penentuan kemurnian & kadar DNA, PCR, Elektroforesis dan Staining. 2.PCR memungkinkan untuk dianalisa DNA profiling meskipun sample biologis sedikit. 3.Pada pemeriksaan DNA Profiling bercak sperma dan sample darah tersangka pada lokus vWA, THO1 dan D17S5 dengan hasil identik

SARAN UNTUK LEBIH SPESIFIK PERLU PEMERIKSAAN DNA MITOKONDRIA (mt DNA) & SEKWENS DNA

TERIMA KASIH